長白豬PPARα、PPARγ 基因的克隆、表達及生物信息學分析

郭振清，李紅強，孫 健

（河北科技師范學院農學與生物科技學院，河北昌黎 066600）

白色脂肪組織主要以儲存能量為主，而棕色脂肪主要以消耗能量和產生熱量為主[1]。研究發現脂肪組織形成的起始階段、分化階段和成熟階段受到各種轉錄因子調控，其中PPAR 家族蛋白在各階段發揮重要作用[2]。PPAR 家族屬于配體激活類轉錄因子，可被細胞內游離脂肪酸和脂肪酸代謝物等多種配體激活[3-4]，PPAR 蛋白與靶基因啟動子的特異靶向元件序列結合，隨后與類維生素A 受體形成異源二聚體驅動生理或病理條件下基因的表達[5-6]。PPAR 家族蛋白調控特異性靶基因的表達[7]，參與脂代謝、葡萄糖穩態、肥胖、癌癥、炎癥和動脈粥樣硬化等生物學過程[8-9]，該家族有PPARα、PPARβ/δ和PPARγ3 個成員，其在不同的組織中表達。PPARα主要在脂肪酸氧化率較高的組織中表達，如肝臟、心臟、肌肉和棕色脂肪組織等[10]，參與游離脂肪酸激活和延伸及去飽和、甘油三酯及脂滴的合成與分解、載脂蛋白代謝、糖異生和膽汁酸代謝等多種生物學過程。PPARβ/δ主要在肌肉中高表達，其次為脂肪組織和皮膚。PPARγ主要在脂肪組織中高表達[11-12]，在調節脂肪細胞分化、脂質生成和代謝方面具有十分重要的作用，其在炎癥反應中也發揮重要作用[2]。

目前對于該家族的研究主要集中在小鼠[13-14]，而以豬為對象的研究較少。豬肉品質（多汁性、風味、柔軟程度）與脂肪沉積緊密相關[15]，如何改善脂肪沉積一直是育種工作者的重要目標。本研究通過構建長白豬PPARα、PPARγ真核表達載體并對其進行生物信息學和組織表達規律分析，為進一步揭示PPARs在豬中的作用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本實驗選擇6 月齡去勢長白公豬，來自河北省秦皇島市昌黎縣肉聯廠，采集長白豬新鮮心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腿肌、頸闊肌、肱二頭肌、皮下脂肪、胃、小腸和空腸12 種組織樣品，樣品采集后迅速置于液氮中，以備后續實驗使用，所有樣品均在-80℃低溫保存。

1.2 主要試劑 Trizol、PCR 相關試劑、RNA 反轉錄試劑盒、pMD18-T Vector、感受態細胞DH5α和DL2000 DNA Ladder 購自北京索萊寶生物科技有限公司；普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒（美國Omega 公司）；DEPC、Goldenview 型核酸染色劑購自北京拜爾迪生物科技有限公司；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）；普通PCR 儀（ABI17500，美國ABI 公司）；定量PCR 儀（賽默飛世爾，美國）；電泳儀（DYY-4C 型，北京市六一儀器廠）。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物設計和合成 參考GenBank 數據庫中豬PPARα（登錄號：NM_001044526），PPARγ（登錄號：NM_214379.1）序列，使用Primer 5.0 軟件設計引物[16]（表1）并由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。

1.3.2 總RNA 提取和反轉錄 取適量組織加入到預冷的2 mL EP 管中，隨后加入1 mL 的Trizol 試劑，使用組織破碎儀（70.0 HZ，20 s）連續破碎5 次后加入200 mL氯仿，隨后12 000 r/min 低溫離心15 min；將上層液體移至新EP 管中并加等體積異丙醇，混勻后放置10 min，12 000 r/min 低溫離心15 min；將上層液體棄去留下底部沉淀，加入1 mL 75%乙醇，重復該過程，最后加20 μL DEPC 水溶解總RNA，并用反轉錄試劑盒將提取的總RNA 反轉錄成cDNA，方法參照試劑盒說明書。

1.3.3 基因擴增 以cDNA 為模板，利用上述引物（表1）通過PCR 技術擴增長白豬PPARα、PPARγ基因。PCR反應總體系為10 μL：5 μL 2×Taq Master Mix、100 ng/μL模板1 μL、上下游引物（10 pmol/L）各0.5 μL、3 μL H2O。PCR 擴增程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環；72 ℃，5 min；20℃，5 min。將PCR 回收產物與pMD18-T 載體連接，連接體系為10 μL：目的片段6 μL，載體2 μL，Buffer 1 μL 和pMD18-T 連接酶1 μL，16 ℃連接過夜后轉化至DH5α感受態細胞，挑取單克隆菌株并進行PCR 鑒定。以上述重組載體為模板利用PCR 技術克隆基因CDS 序列，與pcDNA3.1 載體相連，隨后轉化至DH5α感受態細胞，最后挑取單菌落并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.4 生物信息學分析 采用表2 中的各種工具對長白豬PPARα、PPARγ對應序列進行生物信息學分析。PPARα、PPARγ物種類型分別為人（Homo sapien）、獼猴（Macaca mulatta）、小鼠（Mus musculus）、豬（Sus scrofa）、牛（Bos tauru）、山羊（Capra hircu）、綠頭鴨（Anas platyrhynchos）、雞（Gallus gallus）。

1.3.5 基因組織表達分析 以12 種組織的cDNA 為模板，使用定量PCR 引物序列（表1），參照TAKARA SYBR?Premix Ex TaqTMII 試劑盒進行熒光定量PCR 檢測基因在各組織中的表達量。PCR 反應體系20 μL：SYBRqPCR Mix 10 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物（10 pmol/L）各0.4 μL，ROX Reference Dye2 0.4 μL，去離子水6.8 μL。PCR 反應條件：預變性95℃ 5 min；循環反應，95℃10 s，60℃ 30 s，共40 個循環。采用GAPDH為內參校正個體間差異，利用2-△△Ct方法計算長白豬PPARα和PPARγ在各組織中的相對表達量，并使用GraphPad Prism5 軟件[19]將表達量進行單因素方差分析。

表1 PCR 引物序列信息

表2 生物信息學軟件[17-18]

2 結果

2.1 長白豬PPARα、PPARγ基因的擴增 由圖1-A 可知，與DNA Ladder Marker 相比，1、2 泳道條帶均處于1 000～2 000 bp，PPARα序列長度為1 407 bp，PPARγ序列長度為1 515 bp，擴增片段大小與理論產物一致。將擴增產物與載體連接并轉化至感受態細胞，挑取單菌落并提取質粒，使用PCR 技術檢測質粒并經瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1-B），發現構建好的載體大小于預期相符合，經生工生物工程（上海）股份有限公司測序獲得核苷酸序列與NCBI 數據庫公布的序列一致。

2.2 生物信息學分析

2.2.1 蛋白質的一級結構 分析長白豬PPARα基本理化性質顯示，編碼468 個氨基酸，其分子量為52.17 ku，理論等電點為5.77，含有亮氨酸（Leu）個數為49，比例最高，為10.5%，而色氨酸（Trp）個數為1，比例最低，為0.2%，其分子式為C2308H3654N618O695S31，總原子數目為7306。PPARγ編碼504 個氨基酸，分子量為57.51 ku，理論等電點為5.60，其中亮氨酸（Leu）比例最高，為10.5%，而色氨酸（Trp）比例最低，為0.2%，含有負電荷氨基酸殘基的數目為71，含有正電荷的氨基酸殘基數目為58，其分子式為C2575H4046N670O766S27，總原子數量為8 084。

2.2.2 蛋白質二級結構預測 長白豬PPARα二級結果分析顯示，α螺旋、無規卷曲、伸展鏈和β轉角分別占48.93%、35.90%、10.68%和4.49%。長白豬PPARγ二級結構分析顯示，α螺旋、無規卷曲、伸展鏈和β轉角分別占比為46.63%、34.92%、12.30%和6.15%。該結果顯示這2 種蛋白α螺旋和無規卷曲是其主要結構。

圖1 長白豬PPARα 和PPARγ 基因的PCR 擴增結果

2.2.3 蛋白質跨膜結構域和疏水性預測 跨膜結構域分析結果顯示，PPARα蛋白不含有TMHs，同樣PPARγ預測發現其TMHs 數量為0，推測這2 種蛋白均不含有跨膜結構域。親疏水性算法認為大于0.5 的區域為疏水區，小于-0.5 的區域為親水區，在-0.5～0.5 的區域為兩親區域。結果顯示長白豬PPARα親疏水性的最小值為-3.078，最大值為2.933，親水性區域大于疏水性區域，因此推測該蛋白為親水性蛋白。長白豬PPARγ親疏水性分析發現，最小值為-2.789，最大值為3.6，親水性區域大于疏水性區域，因此推測該蛋白為親水性蛋白。

2.2.4 蛋白質磷酸化位點預測 磷酸化位點通常在蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）和賴氨酸（Tyr）3 個氨基酸殘基上。預測結果顯示，長白豬PPARα共有45 個磷酸化位點，其中蘇氨酸殘基上有15 個，分別位于4、52、71、82、129、190、200、253、279、283、285、288、307、438、450 氨基酸殘基；絲氨酸殘基上有25個，分別位于6、12、21、24、38、40、45、46、48、50、59、63、66、73、76、77、80、93、110、142、163、179、205、293、346 氨基酸殘基；賴氨酸殘基上有5 個，分別位于54、83、314、464、468 氨基酸殘基。同樣方法預測到50 個PPARγ磷酸化位點，其中蘇氨酸殘基上有14 個，分別位于 4、19、29、33、40、65、74、165、256、265、268、269、324、343 氨基酸殘基；絲氨酸殘基上有27 個，分別位于 8、14、25、45、50、56、58、70、71、103、111、116、185、225、226、235、248、252、272、281、359、369、382、409、421、456、491 氨基酸殘基；賴氨酸殘基上有9個，分別位于77、101、115、150、249、326、354、500、504 氨基酸殘基。糖基化位點修飾分為兩種，即O 端和N 端糖基化位點，利用在線軟件NetOGlyc3.1和NetNGlyc1.0 分析O 端和N 端糖基化位點發現，長白豬PPARα共有14 個O 端糖基化位點，分別位于4、63、69、71、73、76、80、82、93、95、196、179、234 氨基酸殘基，沒有檢測到N 端糖基化位點，長白豬PPARγ共有18 個O 端糖基化位點分別位于14、19、25、29、71、103、111、116、119、130、203、235、248、265、268、269、272 和295 氨基酸殘基，檢測到23 位氨基酸殘基處有1 個N 端糖基化位點。

2.2.5 蛋白質三級結構預測 對長白豬的PPARα、PPARγ編碼蛋白質的三級結構進行建模（圖2），可以看出2種蛋白的三級結構總體十分相似，但2 種蛋白的氨基酸總數存在區別，在三級結構也存在不同，文中用紅色標記出兩者的不同。從三級結構中發現2 種蛋白α螺旋和無規卷曲占比例較高，與二級結構預測的結果一致。PPARα在99～173 位氨基酸殘基為DNA 結合結構域，PPARγ的135～209 位氨基酸殘基為DNA 結合結構域，兩者該結構域相似性82.67%。PPARα在239～466 位氨基酸殘基為配體結合結構域，PPARγ的237～502 位氨基酸殘基為配體結合結構域，兩者該結構域相似性64.04%。

圖2 長白豬PPARα 和PPARγ 蛋白質三級結構預測

2.2.6 長白豬與其他物種系統進化樹構建 對8 個物種的PPARα、PPARγ蛋白質氨基酸序列進行同源性比較，并建立系統進化樹。如圖3-A 顯示，豬的PPARα蛋白質氨基酸序列與牛和山羊的親緣關系較近，其次為小鼠和人，與綠頭鴨和雞的親緣關系最遠，山羊、牛和豬同屬于偶蹄目，由此說明該蛋白在進化過程中較為保守。PPARγ蛋白質氨基酸序列的親緣關系與PPARα不同，豬的該蛋白與人、獼猴和小鼠的親緣關系較近，與山羊和牛的親緣關系次之，與綠頭鴨和雞的親緣關系最遠（圖3-B），由于該蛋白的氨基酸序列在跨越不同的目和科，在保守性方面較PPARα差。

圖3 長白豬PPARα 和PPARγ 與其他物種氨基酸系統進化樹

將豬PPARα序列與其他各物種序列比較發現（圖4），豬與牛的同源性最高，為94.9%，其次為山羊94.7%，與進化樹關系所得結果一致。將豬PPARγ序列與其他各物種序列比較發現（圖5），豬與人的同源性最高，為98.5%，其次為獼猴和小鼠，分別為98.2%、98.1%，與進化樹關系所得結果一致。

2.3 長白豬PPARα、PPARγ基因的組織表達譜 如圖6-A所示，PPARα在長白豬的肝臟中表達量最高，其次為腎臟、脂肪組織和胃，脾臟的表達量最低，該基因在這些組織的表達量較其他組織均達到差異極顯著水平；其他各組織均有表達。由圖6-B 可知，PPARγ在長白豬的脂肪組織中表達量最高，胃中表達量次之，該基因在這2種組織中表達量與其他組織達到極顯著差異水平；其他各組織表達量較低且種間未達到差異極顯著水平。

圖4 不同物種PPARα 序列差別（下三角）和相似性（上三角）

圖5 不同物種PPARγ 序列差別 (下三角) 和相似性 (上三角)

圖6 長白豬PPARα 和PPARγ 基因在各組織中的表達量

3 討 論

本研究成功克隆了長白豬的PPARα、PPARγ基因，測序PPARα基因CDS 區全長為1 407 bp，編碼468 個氨基酸；PPARγ基因CDS 區全長1 515 bp，編碼504個氨基酸，克隆得到的序列與GenBank 數據庫中的豬PPARα、PPARγ序列一致。通過親緣關系分析，發現PPARα、PPARγ的保守性都很強，該結果與在廣西巴馬小型豬中研究結論一致[20]。目前對不同品種豬中這2種基因有效遺傳變異位點的研究尚未報道，在后續的研究中通過擴大樣品量篩選有效的遺傳標記，為豬育種工作提供依據。

對兩基因序列進行生物信息學分析的結果顯示，長白豬PPARα、PPARγ2 種蛋白二級結構以α螺旋和無規卷曲為主，與三級結構預測結果一致。這2 種蛋白均不含有跨膜結構域，為親水性蛋白，該預測結果與2 種蛋白作為轉錄因子調控特異性基因的轉錄表達相符合，因為它們發揮功能時首先轉移至細胞核，而非與膜結構相結，同時對其保守結構域分析發現，長白豬PPARα、PPARγ均由DNA 結合結構域和配體結合結構域，且同源性較高。PPAR 屬于核受體家族成員，其活性受到多種翻譯后修飾，包括磷酸化、糖基化、泛素化和類泛素化等多種形式[21-22]。本研究在蛋白質翻譯后修飾預測中也發現2 種蛋白含有多個磷酸化位點和一些糖基化位點。

本研究采集了長白豬12 個不同部位的組織樣品，通過qT-PCR 技術檢測PPARα、PPARγ的表達量，發現PPARα基因在肝臟中高表達。饒遼源等[23]研究證明PPARα主要在山羊的腎臟和肝臟中表達較高。另有報道PPARα在不同品種豬、不同周齡豬的肝臟組織表達水平存在差異[21]，提示該基因存在物種差異和時序性。本研究發現，PPARγ基因在脂肪組織中表達量最高，這與江口蘿卜豬、從江香豬和八眉豬各組織中PPARγ基因表達量的結果一致[24-25]，且隨著喂養月齡的不同呈上升趨勢，但廣西巴馬小型豬發現PPARγ基因在大腸組織中表達量最高[20]，該結果表明PPARγ基因在不同的豬品種之間存在表達差異，可能與廣西小型豬特殊的形體有關。另外，在不同冷刺激下PPARγ基因表達量也有不同[26]，提示該基因能量平衡方面具有重要作用。同時，張青青等[27]在黃牛中的研究結果也顯示，在脂肪組織分化的不同時間點PPARγ基因的表達量不同，這些數據說明該基因在脂肪組織中具有重要功能。

4 結 論

本研究成功克隆了長白豬PPARα和PPARγ的CDS序列，其核苷酸序列長度分別為1 407 bp 和1 515 bp，隨后構建了真核表達載體；2 種蛋白主要二級結構為α螺旋和無規卷曲，為親水蛋白且保守性較強；PPARα在長白豬的肝臟中表達量最高，脾臟的表達量最低，PPARγ在長白豬的脂肪組織中表達量最高，胃中表達量次之，提示2 種基因在機體能量代謝方面發揮作用。