青藏高原甜菜紅色素制備工藝優化及不同條件對色素穩定性的影響

蔡庭秀，葉英,3*，趙永珍，劉耀耀，劉哲，喬楊波，王睿燕

(1.青海大學 農牧學院，西寧 810016；2.青海圣航農牧科技開發有限公司，青海 尖扎 811200； 3.青海省青藏高原農產品加工重點實驗室，西寧 810016)

紅甜菜又名菾菜、紫菜頭，石竹目藜科(Chenopodiaceae)甜菜屬植物，該屬包括14個野生種和1個栽培種，可食用也可藥用。原產于歐洲，我國最早的記載見于隋唐藥典中對其藥用價值的描述，現主要分布于我國北部各省區[1-4]。我國甜菜種植的歷史久遠，分布廣泛，資源豐富，人們主要用來食用和喂養家畜。據研究證實，紅甜菜中含有酚類、糖類、生物堿、維生素、黃酮、皂苷及鈣、鐵等有效成分[5-6]，是世界衛生組織確定的最佳蔬菜之一。

甜菜紅色素是由甜菜為原料制得的天然可食用色素，其中糖苷類約占95%，甜菜色素約達90%以上，具有降血壓、增強免疫力、降低腫瘤誘發率、抗氧化、降血糖等功效[7-9]，在醫藥界受到高度重視。此外，甜菜紅色素作為著色劑，色彩鮮艷，均勻無異味，營養價值高，在食品著色和保健品研制方面也受到了廣泛青睞[10]，特別是在酸奶、奶酪等乳制品以及飲料、冰淇淋等水溶性食品的加工中應用廣泛，同時也被當作天然無毒的調味品添加到甜點、果醬、糖果、果凍等食品中[11]，以增加食品感官特性提供營養價值。張忠平等[12]以紅甜菜為原料研制的果醋飲品等新型食品也為紅甜菜的進一步開發提供了新思路。杜國軍等[13]以甜菜干粕為原料, 采用檸檬酸-纖維素酶法提取優質甜菜果膠,可大幅提高制糖企業的效益,具有較好的應用前景。郭慶暉等[14]以紅甜菜為主要原料,研發出一款營養豐富、酸甜可口的紅甜菜葡萄紅棗復合果蔬汁飲料，為紅甜菜資源的深加工提供了一定的技術參考。

甜菜近幾年在青藏高原種植興起，且有逐年擴大趨勢，但研究與加工方面卻比較欠缺，不同生長環境下植物有效成分積累及性質可能會有差別[15]，青藏高原地理環境特殊，可能會造成甜菜紅色素穩定性或使用特性差異。本試驗首次以青藏高原種植的甜菜根為原料，以超聲波提取法為甜菜紅色素的提取方法[16-17]，借助響應面法對甜菜紅色素的制備工藝進行優化，同時通過熱穩定性、光穩定性、酸堿穩定性、耐氧化性、耐還原性及護色試驗對甜菜紅色素的穩定性進行評價，以期為青藏高原甜菜紅色素的科學、合理開發利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮的甜菜塊根：采自青海省大通縣，烘干，粉碎，過60目篩備用。

KQ-800D型臺式醫用數控超聲波清洗儀 東莞市科橋超聲波設備有限公司；721N型可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；HH-6型數顯恒溫水浴鍋 上海宜昌儀器紗篩廠；HJ-4A型數顯恒溫多頭磁力攪拌器 金壇城西崢嶸實驗儀器廠；PHS-3C型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 超聲法提取甜菜紅色素單因素試驗

1.2.1.1 乙醇濃度對甜菜紅色素提取得率的影響

精確稱取0.50 g甜菜根粉末，以超聲法為甜菜紅色素的提取方法，以紅色素得率為考察指標，固定料液比為1∶50，超聲溫度為40 ℃，超聲時間為30 min，選擇乙醇濃度為30%、40%、50%、60%、70%進行甜菜紅色素提取乙醇濃度單因素試驗，按公式(2)計算甜菜紅色素得率，以確定甜菜紅色素最佳乙醇濃度。

1.2.1.2 料液比對甜菜紅色素提取得率的影響

精確稱取0.50 g甜菜根粉末，以超聲法為甜菜紅色素的提取方法，以紅色素得率為考察指標，固定乙醇濃度為50%，超聲溫度為40 ℃，超聲時間為30 min，選擇料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70進行甜菜紅色素提取料液比單因素試驗，按公式(2)計算甜菜紅色素得率，以確定甜菜紅色素最佳料液比。

1.2.1.3 超聲時間對甜菜紅色素提取得率的影響

精確稱取0.50 g甜菜根粉末，以超聲法為甜菜紅色素的提取方法，以紅色素得率為考察指標，固定乙醇濃度為50%，料液比為1∶50，超聲溫度為40 ℃，選擇超聲時間為5，15，25，35，45，55 min進行甜菜紅色素超聲時間單因素試驗，按公式(2)計算甜菜紅色素得率，以確定甜菜紅色素最佳超聲時間。

1.2.1.4 超聲溫度對甜菜紅色素提取得率的影響

精確稱取0.50 g甜菜根粉末，以超聲法為甜菜紅色素的提取方法，以紅色素得率為考察指標，固定乙醇濃度為50%，料液比為1∶50，超聲時間為35 min，選擇超聲溫度分別為20，30，40，50，60 ℃進行甜菜紅色素超聲溫度單因素試驗，按公式(2)計算甜菜紅色素得率，以確定甜菜紅色素最佳超聲溫度。

1.2.2 甜菜紅色素提取響應面試驗

基于單因素試驗，以甜菜紅色素得率為考察指標，選取超聲溫度、超聲時間、料液比為因素，進行響應面試驗，對甜菜紅色素超聲提取工藝進行優化，以確定甜菜紅色素提取最優工藝水平。

1.2.3 甜菜紅色素含量的計算

參考文獻[18]采用分光光度計法，于538 nm處測定甜菜紅色素提取液的OD值，按公式(1)計算甜菜紅色素提取液中甜菜紅色素的含量，按公式(2)計算甜菜紅色素得率。

公式(1)

式中：C為甜菜紅色素提取液中甜菜紅色素含量(g)；OD 為538 nm處甜菜紅色素提取液吸光值；550.11為標準甜菜紅色素摩爾分子質量；61600為標準甜菜紅色素摩爾消光系數。

公式(2)

式中：C為甜菜紅色素提取液中甜菜紅色素含量(g)；V為提取液體積(mL)；m為甜菜根粉末質量(g)。

1.2.4 甜菜紅色素穩定性研究

1.2.4.1 甜菜紅色素溶液配制

取5 g甜菜根粉末制備的提取液，蒸餾水定容至250 mL，密封避光保存備用。

1.2.4.2 熱穩定性試驗

取10 mL上述甜菜紅色素溶液6份，分別置于30，40，50，60，70，80 ℃恒溫水浴30 min，每隔5 min于538 nm處測定甜菜紅色素提取液的OD值，按公式(3)分別計算甜菜紅色素殘存率。

1.2.4.3 光穩定性試驗

取10 mL上述甜菜紅色素溶液2份，分別置于自然光和紫外燈光下8 h，每隔1 h于538 nm處測定甜菜紅色素提取液的OD值，按公式(3)分別計算甜菜紅色素殘存率。

1.2.4.4 酸堿穩定性試驗

取40 mL上述甜菜紅色素溶液12份，用鹽酸和氫氧化鈉調節甜菜紅色素溶液pH值分別至2.1，3.2，4.0，5.2，5.9，7.3，8.0，9.0，10.1，11.3，12.1，13.0于538 nm處測定甜菜紅色素溶液的OD值，觀察吸光值的變化及顏色反應。

1.2.4.5 耐氧化性試驗

取10 mL上述甜菜紅色素溶液4份，分別加入0.2%、0.4%、0.8%、1.6%的過氧化氫溶液2 mL，室溫放置反應48 h，并分別于反應40 min，4，6，12，24，48 h時，在538 nm處測定甜菜紅色素溶液的OD值，按公式(3)分別計算甜菜紅色素殘存率。

1.2.4.6 耐還原性試驗

取10 mL上述甜菜紅色素溶液3份，分別加入0.1%、0.2%、0.3%亞硫酸鈉溶液2 mL，室溫放置反應120 min，并分別于反應30，60，120 min時，在538 nm處測定甜菜紅色素溶液OD值，按公式(3)分別計算甜菜紅色素殘存率。

1.2.4.7 護色試驗

取10 mL甜菜紅色素溶液8份，分別加入0.05%、0.1%、0.2%、0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.5%的抗壞血酸2 mL，室溫放置反應48 h，并分別在反應5，25，48 h時，于538 nm處測定甜菜紅色素的溶液OD值，按公式(3)分別計算甜菜紅色素殘存率。

1.2.4.8 色素殘存率的計算

參考張琳等[19]的方法，采用摩爾消光系數法計算甜菜提取液中甜菜紅色素的含量。

(3)

式中：A0為某一條件處理后紅色素溶液的吸光值；A1為對照組中紅色素溶液的最大吸光值。

2 試驗結果與分析

2.1 甜菜紅色素提取單因素試驗結果與分析

2.1.1 乙醇濃度對甜菜紅色素得率的影響

乙醇濃度對甜菜紅色素得率的影響結果見圖1。

圖1 乙醇濃度對甜菜紅色素得率的影響Fig.1 The effect of ethanol concentration on the yield of beet red pigment

由圖1可知，紅色素的提取得率隨乙醇濃度的增加不斷增加，當乙醇濃度為50%時，色素提取得率最高，為0.134%，當乙醇濃度大于50%時，紅色素的得率呈下降趨勢，分析原因可能是甜菜紅色素為水溶性色素，適當的濃度可以破壞植物細胞脂質結構，利于色素溶出，但隨著乙醇濃度的進一步增大，甜菜根中的一些非色素物質逐漸溶出，雜質增多，使得紅色素得率降低，因此乙醇濃度為50%是甜菜紅色素提取最佳濃度。

2.1.2 料液比對甜菜紅色素得率的影響

料液比對甜菜紅色素得率的影響結果見圖2。

圖2 料液比對甜菜紅色素的得率的影響Fig.2 The effect of solid-liquid ratio on the yield of beet red pigment

由圖2可知，紅色素提取得率隨料液比的增大先升高后下降，當料液比為1∶50時，紅色素得率最高，達0.157%，當料液比大于1∶50時，紅色素的得率隨料液比的增大反而降低，分析原因可能是溶劑過多，色素濃度降低，增加了雜質溶出，導致色素得率降低，因此提取甜菜紅色素時料液比應該控制在1∶50左右為宜。

2.1.3 超聲時間對甜菜紅色素得率的影響

超聲時間對甜菜紅色素得率的影響結果見圖3。

圖3 超聲時間對甜菜紅色素得率的影響Fig.3 The effect of ultrasonic time on the yield of beet red pigment

由圖3可知，當超聲時間從5 min延長至35 min時，紅色素得率不斷增加；當超聲時間為35 min時紅色素得率最高，為0.111%；當繼續延長超聲提取時間，紅色素的提取得率呈下降趨勢，分析原因可能是前期隨著超聲時間增加溶出的色素逐漸增多，到35 min時色素溶出率接近飽和，繼續延長超聲時間，雜質溶出，甜菜紅色素得率降低。因此甜菜紅色素的超聲時間應控制在35 min左右。

2.1.4 超聲溫度對甜菜紅色素得率的影響

超聲溫度對甜菜紅色素得率的影響結果見圖4。

圖4 超聲溫度對甜菜紅色素得率的影響Fig.4 The effect of ultrasonic temperature on the yield of beet red pigment

由圖4可知，紅色素得率隨溫度的升高而增大，當超聲溫度為40 ℃時，紅色素得率達到最大值，為0.234%；當超聲溫度大于40 ℃時，紅色素的得率隨超聲提取溫度的升高而降低，分析原因可能是溫度過高溶劑揮發過多，溶劑與甜菜根粉末的接觸面積減小，同時部分紅色素結構被破壞，甜菜苷類被分解，因而使得溶液中的紅色素得率降低，因此建議甜菜紅色素最佳超聲溫度為40 ℃左右。

2.2 甜菜紅色素提取響應面試驗結果與分析

2.2.1 響應面設計與結果

基于單因素試驗結果，設計響應面試驗，因素水平見表1，試驗結果見表2。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 The factors and levels of response suface test

表2 甜菜紅色素提取響應面試驗結果Table 2 The response surface test results of beet red pigment extraction

續 表

對試驗結果進行多元回歸分析，得到回歸方程：得率=0.25-1.000E-003A-7.500E-004B-5.000E-004C-0.021A2-9.400E-003B2-0.014C2+0.000AB-5.000E-003AC+5.000E-004BC，方程二次項系數均為負數，故方程有最大值，符合試驗設計要求。

2.2.2 方差分析

方差分析結果見表3。

表3 方差分析結果Table 3 The results of variance analysis

由表3可知，該試驗模型P<0.01(極顯著)，失擬項P=0.8660(不顯著)，此外，該模型相關系數R2=0.9803，說明該模型設計合理，能充分擬合試驗數據，可用于甜菜紅色素提取過程的分析和預測。在所設計的試驗范圍內各因素對紅色素得率的影響依次為A>B>C，即料液比>溫度>時間。

2.2.3 交互作用分析

各因素交互作用關系見圖5～圖7。

圖5 超聲時間和料液比Fig.5 Ultrasonic time and solid-liquid ratio

圖6 超聲溫度和料液比Fig.6 Ultrasonic temperature and solid-liquid ratio

圖7 超聲時間和超聲溫度Fig.7 Ultrasonic time and ultrasonic temperature

在一個因素水平固定的情況下，各因素對甜菜紅色素得率的影響均存在兩兩相互依賴的關系。由圖5可知A，C交互作用的三維圖較陡，顏色變化較為明顯，且等高線圖呈橢圓形，說明因素A，C的交互作用對得率影響較大，料液比的曲線變化幅度大，表明其對紅色素得率的影響較大；由圖6中的B，A交互作用和圖7中的B，C交互作用關系圖可知，三維圖坡面較陡，等高線圖呈橢圓形，但顏色變化不顯著，故溫度與料液比及時間的交互作用對甜菜紅色素得率的影響并不明顯。B與C坡面差異不大，說明二者對甜菜紅色素得率的影響接近，但不同提取時間下，甜菜紅色素最大得率對應的時間卻有差異。

2.2.4 甜菜紅色素提取最優條件驗證

響應面優化得到超聲提取甜菜紅色素的最優條件為：提取時間33.86 min，提取溫度39.57 ℃，料液比1∶ 55.39，此條件下預測紅色素得率為0.248%，便于試驗操作將此條件修正為提取時間34 min，提取溫度40 ℃，料液比1∶50，經試驗驗證得到此條件下甜菜紅色素的實際得率為0.251%，試驗結果與預測值無顯著差異。

2.3 甜菜紅色素的穩定性研究試驗結果與分析

2.3.1 熱穩定性試驗結果

圖8 甜菜紅色素熱穩定性試驗結果Fig.8 The results of thermal stability test of beet red pigment

由圖8可知，隨著水浴溫度的升高和水浴時間的延長，甜菜紅色素的殘存率逐漸降低。在溫度相對較低的環境中(40 ℃以下)甜菜紅色素降解速度較慢，故低溫能緩解紅色素的分解，在高溫環境中甜菜紅色素降解速度非?？?，在80 ℃下熱處理30 min時色素損失已達到44%。所以，甜菜紅色素受溫度影響較大，此結果與熊勇等[20]的研究結果一致，建議甜菜紅色素儲存和使用溫度控制在30 ℃以下。

2.3.2 光穩定性試驗結果

圖9 甜菜紅色素光穩定性試驗結果Fig.9 The results of light stability test of beet red pigment

由圖9可知，甜菜紅色素在紫外光和自然光照射下隨著時間的延長其殘存率逐漸降低，但照射后，色素殘存率仍保持在90%左右，說明短時間內甜菜紅色素對自然光和紫外線的敏感度不是特別高，此結論與熊勇等的研究結果近乎一致，但長時間光照對色素破壞仍十分嚴重。此外，研究發現甜菜紅色素殘存率受自然光與紫外光照射的影響規律有較大差別，甜菜紅色素在自然光照射前4 h內其殘存率呈直線下降趨勢，當自然光照射時間為4 h時色素殘存率不到93%，而紫外光照射4 h時色素殘存率仍有97.3%，隨著光照時間的進一步延長，自然光和紫外光對甜菜紅色素殘存率的影響逐漸趨近，由此說明，與紫外光相比，在短時間內自然光對甜菜紅色素的穩定性影響更大，因此如果利用甜菜紅色素作為食品添加劑時，應盡量避免光照，尤其青藏高原光照強且光照時間長，因此使用甜菜紅色素時建議最好避光。

2.3.3 酸堿穩定性試驗結果

表4 甜菜紅色素酸堿穩定性研究試驗結果Table 4 The results of acid-base stability test of beet red pigment

由表4可知，酸堿對甜菜紅色素影響較大，溶液pH在2.1～7.3范圍時紅色素的吸光度值隨pH值的增大而增加，且溶液中色素的顏色逐漸加深，pH在5.2～5.9時溶液的吸光值最大，pH為7.3時，溶液顏色最深。當溶液pH大于7.3時，吸光度值逐漸降低，溶液顏色逐漸變淺，甜菜紅色素隨pH的進一步增加顏色由紅色變為黃色，分析原因可能是堿性條件下甜菜紅色素轉變為甜菜黃素。因此綜合分析上述試驗數據，建議甜菜紅色素最佳使用pH范圍為4～7。

2.3.4 耐氧化性試驗結果

圖10 甜菜紅色素耐氧化性試驗結果Fig.10 The results of oxidation resistance test of beet red pigment

由圖10可知，隨著H2O2濃度的增加和作用時間的延長，甜菜紅色素的殘存率逐漸降低，但總體變化不大。當用濃度為1.6% 的H2O2處理甜菜紅色素溶液40 min時，色素殘存率為98.6%，當處理時間達48 h時，色素殘存率仍保持在96.9%，說明強氧化劑對甜菜紅色素具有一定的影響，但影響作用有限，這與氧化劑的濃度及作用時間均有關系，總體而言，甜菜紅色素的耐氧化性相對較好。

2.3.5 耐還原性試驗結果

圖11 甜菜紅色素耐還原性試驗結果Fig.11 The results of reducing resistance test of beet red pigment

由圖11可知，隨著亞硫酸鈉濃度的增加和作用時間的延長，甜菜紅色素的殘存率逐漸降低，且亞硫酸鈉的濃度占主導作用。同樣處理120 min，當亞硫酸鈉濃度為0.1%時，甜菜紅色素殘存率為97%；當亞硫酸鈉濃度為0.3%時，甜菜紅色素殘存率僅為95.3%。亞硫酸鈉濃度相同的條件下，處理時間對甜菜紅色素殘存率影響不大，當亞硫酸鈉濃度為0.3%時，處理120 min與處理30 min相比，色素殘存率僅降低了0.6%。由此說明，還原劑對甜菜紅色素具有一定的影響，且主要與還原劑的強弱有關，因此甜菜紅色素在應用過程中應盡量避免與還原性物質接觸或應控制還原性物質的濃度。

2.3.6 護色試驗結果

圖12 甜菜紅色素的護色試驗結果Fig.12 The results of color protection test of beet red pigment

由圖12可知，在高濃度抗壞血酸作用下，甜菜紅色素的殘存率歲抗壞血酸作用時間的延長逐漸增加，溶液顏色逐漸變深，當濃度為1.5%的抗壞血酸作用48 h時，色素殘存率可達113.7%，在低濃度抗壞血酸作用下，甜菜紅色素的殘存率隨抗壞血酸作用時間的延長反而呈下降趨勢，且溶液顏色變淺，當抗壞血酸濃度為0.05%，作用時間由5 h延長至48 h時，甜菜紅色素殘存率由97.2%降為91.9%，由此可見，不同濃度的抗壞血酸對甜菜紅色素殘存率的影響規律差異較大，較高濃度的抗壞血酸可起到增色作用，故建議在甜菜紅色素使用過程中適量加入一定濃度的抗壞血酸，以提高色彩強度。

3 試驗結論

本文借助超聲法以乙醇為溶劑提取甜菜紅色素，通過單因素試驗及響應面試驗得出甜菜紅色素的最佳提取條件為：乙醇提取濃度50%，料液比1∶50，超聲溫度40 ℃，超聲時間34 min，此條件下甜菜紅色素提取得率為0.251%。甜菜紅色素穩定性試驗表明，甜菜紅色素穩定性易受環境因素的影響，紅色素在pH 4～7環境中穩定性較好，高溫、高濃度氧化劑及紫外燈長時間作用對甜菜紅色素穩定性影響較大，此外，較高濃度抗壞血酸可起到保護甜菜紅色素的作用。因此甜菜紅色素應盡量在低溫、避光、低酸性條件下儲存和使用，且避免與還原劑接觸，適當添加抗壞血酸可有效提高紅色素色彩強度。如果在青藏高原地區使用甜菜紅色素，應避免自然光中的紫外線照射；在甜菜采收與加工時應避免室外自然晾曬和高溫烘焙。本文研究結果可為青藏高原甜菜的開發利用提供一定的理論依據。