解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens T-6的分離鑒定及抗病促生潛力

要雅倩 成娜娜 李培根盧毅王彥剛 林榕姍 周波

王冰1，2

（1. 山東農業大學，泰安 271018；2. 山東鹽堿地植物-微生物聯合修復工程技術研究中心，泰安 271018；3. 寧夏中青農業科技有限公司，寧夏 750000）

桃（Amygdalus persica L.）起源于我國西北高原地區，是我國最古老的栽培樹種之一［1］。近年來，桃類產業發展迅速，桃樹種植面積逐年上升，許多老果園亟待更新，但受用地及產業發展的限制，很多果園都需要在原地重建。桃樹自身的自毒作用加上農藥化肥的長期濫用，土壤理化性質惡化、營養失衡、病原物增多，加劇了桃樹栽培過程中病蟲害的發生［2-3］。

桃樹根腐病，別稱爛根?。≒each root rot），是桃樹連作障礙中重要的土傳病害。該病害一般由土壤習居菌鐮刀菌侵染所致［4-5］，常發生在地勢低洼，土壤黏重，排水不良的地塊。此病害最先危害桃樹根部，先是須根變褐枯死，而后是側根和主根，隨著病害的加重，病斑不斷變大甚至可深達木質部，最后整段根都枯死［6］。目前，多用化學手段來防控桃樹根腐病，并沒有一種真正意義上有效且環境友好的防治措施?？捎糜诜乐胃鞣N作物病害的芽胞桿菌菌劑就成為了化學農藥和化肥的極佳替代品。

芽胞桿菌（Bacillusspp.）廣泛存在于自然界中，具有對不良環境極強的抗逆性，是一種可以形成芽孢的革蘭氏陽性桿狀細菌［7-9］。作為生物防治中的明星菌種，芽胞桿菌可以顯著影響植物根際土壤中關鍵酶的活性以及微生物的多樣性。本研究從桃樹根腐病發病桃園健康植株根際分離篩選，獲得對多株土傳病原菌具有較好拮抗效果的生防芽胞桿菌，經形態學、生理生化和分子生物學系統性鑒定，對其抗病和促生效果進行實驗室和盆栽試驗評價，為可防治桃樹根腐病等多種土傳病害的生物肥料與生物農藥的開發應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病原菌株和土壤樣品 供試土樣：2018年12月采集江蘇泗洪縣桃樹根腐病發病果園中健康植株根際土壤，裝入到無菌樣品袋中、密封、編號，于實驗室中4℃保存。

抗菌譜供試病原菌：AMCC100027串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）、AMCC100029腐皮鐮刀菌（F. solani）、AMCC100025層出鐮刀菌（F. proliferatum）、AMCC100030絲核菌（Rhizoctonia solani）、AMCC400016普 通 瘡 痂 鏈 霉菌（Streptomyces scabieis）、AMCC400044酸瘡痂鏈霉菌（S. acidiscabies）、AMCC辛1-3腫痂鏈霉菌（S.Turgidis）、鏈霉菌AMCC400023均由山東農業大學AMCC資源與環境微生物研究室保藏。

1.1.2 供試材料 盆栽試驗番茄品種為3716。

1.1.3 培養基 LB培養基：酵母膏5.0 g，NaCl 10.0 g，蛋白胨10.0 g，瓊脂20.0 g，水1 L，pH 7.0-7.5。

高氏I號培養基：可溶性淀粉20.0 g，KNO31.0 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂20.0 g，水1 L，pH 7.2-7.4。

脫脂奶粉培養基：脫脂奶粉5.0 g，瓊脂18.0 g，水1 L，pH 7.0。

纖維素培養基：C6H7O2（OH）2CH2COONa 1.0 g，蛋白胨1.0 g，酵母膏0.5 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，NaCl 1.0 g，KH2PO40.1 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 L，pH自然。

幾丁質培養基：幾丁質5.0 g，蛋白胨2.0 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，瓊脂20.0 g，水1 L，pH 7.2。

果膠培養基：果膠5.0 g，蛋白胨2.0 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，瓊脂20.0 g，水1 L，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 生防菌的篩選

1.2.1.1 生防菌分離 將10 g采集的土壤樣品加入90 mL無菌水中（含Φ3.5 mm玻璃珠），充分振蕩后，80℃水浴0.5 h，靜置15 min。將上清液梯度稀釋（10-3-10-5）后，于LB培養基上涂布，37℃培養24 h，挑取不同的菌落分離純化，2-3次后，將獲得的菌株編號后保藏。

1.2.1.2 生防菌初篩 將病原腐皮鐮刀菌活化到長滿平板，用無菌的打孔器（Φ10 mm）打成均勻的圓形菌塊，轉接到PDA平板中間，28℃培養2 d后用接種環挑取純化好的細菌接種到距病原真菌菌餅邊緣2 cm處，28℃繼續培養4-5 d。待病原真菌菌體長滿平板，觀察有無抑菌帶出現。

1.2.1.3 生防菌復篩 采用雙層平板牛津杯法［10］進行試驗。將待試菌株發酵培養得種子發酵液。將各菌株種子液接種到0.1 L的LB液體培養基中，發酵培養24 h后，4℃離心20 min，經0.22 μm無菌濾膜過濾得無菌發酵上清液。將100 μL（105CFU/mL）腐皮鐮刀菌的發酵液均勻涂布，用鑷子將牛津杯放置在平板兩側，吸取100 μL濾菌發酵上清液至牛津杯中?？瞻诪閮H涂布等量病原發酵液。待病原長滿平板，測量抑菌圈直徑以及抑菌率（抑菌圈直徑/病原菌生長直徑）。

1.2.1.4 生防菌株抗菌譜的測定 將供試菌株活化后培養備用。將100 μL濃度為105CFU/mL的各供試病原菌（共8種）的發酵液涂布，刮取少量的待測細菌菌苔均勻點接于距離培養基中心2.5 cm處，對照組是將等量105CFU/mL的各病原菌發酵液均勻涂布。待對照組各病原菌長滿整個平板時，測量抑菌圈直徑以及病原菌生長半徑r，對照組半徑為平板半徑r0，利用公式（r0-r）/r0計算抑菌率。

結合初篩、復篩及抑菌譜結果，從待測細菌中選取抑菌效果突出的一株進行后續研究。

1.2.2 生防菌T-6系統鑒定

1.2.2.1 形態學鑒定 參照《常見細菌系統鑒定手冊》［11］中形態學指標觀察菌落性狀，進行革蘭氏染色觀察。

1.2.2.2 生理生化鑒定 參照《常見細菌系統鑒定手冊》進行葡萄糖、淀粉水解試驗等反應測定。

1.2.2.3 Biolog系統分析 TSA培養基33℃培養生防菌16-24 h，用無菌棉棒蘸取IF-B接種液后，將接種液攪拌均勻。調整濁度儀濁度到90%-98%T，將菌懸液倒入加樣水槽中，用移液槍依次接種到鑒定板上，每孔100 μL。反應24-36 h后，放入讀數儀中，設置參數后讀取菌株的代謝指紋信息。

1.2.2.4 分子鑒定

（1）16S rDNA序列擴增：用康為試劑生物科技有限公司DNA提取試劑盒提取生防菌的基因組DNA后 進 行16SrDNA序 列PCR擴增［12］。引 物 為通用引物27F-5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R-5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR產物測序工作委托上海鉑尚生物技術有限公司完成，將所得到的序列在NCBI上進行序列比對分析，最后用Mega7.0構建系統發育樹。

（2）特異性PCR：經16S鑒定發現該菌株與枯草芽胞桿菌遺傳關系較近，遂采用枯草菌群特異性PCR技術對該菌株進一步鑒定。各引物信息為：解淀粉芽胞桿菌（L100-AAATCTGCCCGTATCGTCG，R836-GCGTCACGGCGRATCTCAA）；枯草芽胞桿菌（BSL72-CGTAGAGCCACTTGAGCG，BSR328-CTGCCGTTACAGTTCCTT）。PCR擴增反應條件為94℃ 3 min；94℃ 0.5 min；61.7℃ 0.5 min；72℃ 0.4 min；延伸72℃ 10 min循環29次（NYT2066-2011）。

1.2.3 生防菌T-6抗病促生檢測與驗證

1.2.3.1 生防菌拮抗因子檢測

（1）蛋白酶檢測：將菌株T-6接種到脫脂奶粉培養基平板上，37℃培養2 d，看有無透明圈產生。（2）果膠酶檢測：將菌株T-6接種到果膠培養基平板上，37℃培養2 d，觀察是否有透明圈。（3）幾丁質酶檢測：將生防菌株T-6接種到幾丁質培養基平板上，37℃培養2 d，觀察有無透明圈出現。（4）纖維素酶檢測：用纖維素培養基平板培養生防菌株2 d，0.5%剛果紅染液染色，靜置1 h后倒出染液。用5%的NaCl溶液洗脫1 h后倒出，看有無透明圈出現。

1.2.3.2 生防菌促生指標檢測

（1）溶磷、解磷指標的測定：將菌株接種到有機磷和無機磷平板中，28℃ 培養2-5 d，觀察是否有透明圈。（2）解鉀指標的測定：生防菌三區劃線到硅酸鹽培養基中，37℃ 培養72 h，觀察是否有光滑透明油滴狀菌落。

1.2.3.3 番茄幼苗抗病促生盆栽試驗

（1）試驗設計：試驗設置為CK、病原菌、生防菌、病原菌+生防菌4個處理。取3-4片真葉健康、長勢均一的番茄幼苗，定植4-5 d后，2、4處理組灌病原菌發酵液（105CFU/mL）100 mL，其余加等量PDA液體。7 d后，后兩個處理組每株灌100 mL生防菌發酵液（107CFU/mL），其余加等量LB液體。病原與生防菌隔7 d灌一次，各灌3次，管理45 d測量農藝性狀。

（2）測定方法：將植株105℃處理30 min，90℃烘干稱重。葉綠素含量用CT（mg/L）=Ca+Cb=20.2A645+8.02A663來計算，Ca、Cb分別為葉綠素a、b的濃度。用根系掃描儀來觀察根系情況。

病害調查采用番茄根腐病分級標準。0級：無??；1級：莖上出現水漬狀的病斑；2級：莖上病斑擴展，但不超過株高 1/4，不萎蔫；3級：病部超過整株 1/4，延伸至根部不超過株高 3/4，莖基部輕微萎蔫；4級：病部蔓延至全株，包括根和葉柄，莖基部嚴重溢縮，葉片枯萎，死亡。病情指數=∑（各級病株數×相應級別）/（調查總株數×最大級數）×100。防治

效果（%）=（空白對照病情指數-處理病情指數）/空白對照病情指數×100。

1.2.4 運用Excel 2010和SPSS19.0等軟件進行數據統計和分析。

2 結果

2.1 桃樹根腐病生防菌的分離篩選

2.1.1 桃樹根腐病生防菌初篩 初篩共獲得6株對靶標腐皮鐮刀病原菌有拮抗作用的生防芽孢菌，編號為T-1-T-6，如圖1所示。

圖1 生防菌株T-1-T-6拮抗腐皮鐮刀菌初篩結果

2.1.2 桃樹根腐病生防菌復篩 以LB液體培養基為對照，在復篩中T-3、T-6菌株的發酵上清液對桃樹根腐病病原腐皮鐮刀菌有較好的抑菌效果，抑菌率如表1所示分別可達21.16%與22.61%。

2.1.3 生防菌抗菌譜測定 復篩中所用6株生防菌株對串珠鐮刀菌、層出鐮刀菌、絲核菌等病原菌的抑制作用。如表2所示，T-4、T-5、T-6菌株的綜合

表1 生防菌株T-1-T-6拮抗腐皮鐮刀菌復篩結果

拮抗效果較好。圖2中T-6菌株對4種病原真菌的抑菌效果均可達20%以上，對普通瘡痂鏈霉菌的抑制效果可高達33.81%，體現了較為廣譜的抗性，因此，選定T-6菌株進行后續實驗。圖3為T-6菌株拮抗部分真菌與鏈霉菌的結果。

2.2 生防菌T-6系統鑒定

2.2.1 生防菌T-6形態學鑒定 從圖4中可以看出T-6菌株的菌落呈白色，邊緣不規則，中間呈嵴狀突起，濕潤無光澤。革蘭氏染色試驗表明該生防菌株為革蘭氏陽性菌株。

2.2.2 生防菌T-6生理生化鑒定 通過生理生化指標測定分析，菌株T-6可以利用葡萄糖作為碳源，苯丙氨酸脫氨酶、接觸酶指標均為陽性，符合芽胞桿菌屬的生理特性。鑒定結果如表3所示。

2.2.3 生防菌T-6 Biolog分析 通過Biolog系統鑒定分析，將所得鑒定板結果（表4）與標準板布局圖比對，可以初步確定生防菌株T-6為芽胞桿菌，與解淀粉芽胞桿菌的特性類似。

2.2.4 生防菌T-6分子生物學鑒定

2.2.4.1 生防菌T-6 的16S rDNA序列擴增 將測序結果進行Blast同源性比對后，利用Mega7.0構建系統發育樹。如圖5所示，菌株T-6與B.amyloliquefaciens和B. methylotrophicus的系統發育關

表2 拮抗菌株的抗菌譜測定抑菌圈結果

圖2 菌株T-6抗菌譜抑菌結果

圖3 T-6菌株拮抗串珠鐮刀菌（A）及T-6菌株拮抗普通瘡痂鏈霉菌（B）部分結果

圖4 生防菌T-6的形態特征

表3 生防菌株T-6的部分生理生化特性

系最近，自展值可達97%。

2.2.4.2 生防菌T-6特異性PCR擴增 通過特異性PCR，發現菌株T-6可以用B. amyloliquefaciens的特異性引物擴增出條帶（圖6）。結合前面的鑒定結果，可以確定該菌株是B. amyloliquefaciens。

表4 T-6菌株的Biolog鑒定結果

2.3 生防菌T-6抗病促生檢測與驗證

2.3.1 生防菌T-6拮抗因子檢測 檢測結果如圖7所示，T-6菌株的菌落在果膠和纖維素培養基上不產生透明圈，在脫脂奶粉、幾丁質培養基上可產生明顯的透明圈，說明該菌株具有產蛋白酶和幾丁質酶的能力。

2.3.2 生防菌T-6促生性指標測定 T-6菌株溶磷、解磷、解鉀試驗結果如圖8所示。圖8-A、圖8-B圖中，菌落周圍均有較小的透明圈，圖8-C圖中培養基上可長出產莢膜的光滑透明油滴狀菌落，說明該菌株具有一定的溶磷、解磷和解鉀的功能。

圖5 菌株T-6的16S rDNA序列系統發育樹

圖6 菌株T-6特異性PCR結果

圖7 生防菌T-6產蛋白酶（A）、幾丁質酶（B）能力測定結果

2.3.3 生防菌T-6抗病促生盆栽驗證 從菌株T-6番茄盆栽結果中植株（圖9）與根（圖10）的長勢上來看，腐皮鐮刀根腐病菌很大程度上影響了植株的生長，導致病原菌處理過的番茄幼苗長勢在對照和3個處理組中最弱；而生防菌處理組的番茄幼苗長勢最好；其次是生防菌+病原菌處理組，可見生防菌T-6對病原菌與番茄生長均有一定的影響。經統計（表5），將生防菌T-6單處理組與CK進行比較時，發現兩組幼苗在干重、根總長與葉綠素3個方面呈極顯著差異，分別提高31.81%、50.79%、35.11%，其余3個性狀呈顯著差異（P＜0.05），表明了該生防菌株明顯的促生性能。與病原處理組相比，病原菌+生防菌混合處理組的鮮重、干重、株高、莖粗等6個指標均明顯提高，且差異極為顯著（P＜0.01），其中鮮重、干重增長69.43%、77.57%，說明T-6菌株在盆栽試驗中突出的抗病效果。

圖8 T-6菌株溶磷（A）、解磷（B）、解鉀（C）能力測定結果

在病原菌+生防菌的混合處理組中，番茄苗的干重較比CK提高了23.37%，具有極顯著的差異，其余鮮重、株高、莖粗等5個參數均表現出顯著的差異。這兩個處理組的比較結果，充分證明生防菌T-6菌株在盆栽試驗中明顯的拮抗病原菌與促進作物生長的能力。

第3次接種病原菌5 d后，病原菌對照組的植株矮小，莖基部萎蔫，出現根腐病的癥狀，病情指數可達85.25，病原菌+生防菌T-6處理組的病情指數和防效分別為37.09和 56.49%（表6）。說明了T-6菌株具有一定防治根腐病的潛力。

表5 菌株T-6番茄盆栽結果

表6 菌株T-6對番茄根腐病的防治結果

圖9 菌株T-6番茄盆栽試驗

圖10 番茄幼苗掃根結果

3 討論

根腐病主要致病菌為半知菌亞門的鐮刀菌，這類病原菌宿主廣泛，可引起桃樹、番茄等多種作物的根腐病害。傳統防治過程中，農藥化肥長期的濫用迫使土壤中的有益微生物數量驟減，減弱了土壤自身的修復能力［13］。作為一種無毒、無害且生態友好型的方法，生物防治越來越受到人們的歡迎。目前報道的根腐病生防菌，多為枯草芽胞桿菌等常見菌種［14］，對解淀粉芽胞桿菌研究較少。2015年，Sunar等［15］發現B. altitudinis對黃瓜根腐病防效可達66.6%。此外，馬鈴薯瘡痂病作為農業生產中又一種土傳病害，已經成為馬鈴薯產業重要的挑戰。其病原菌主要有S. scabies［16］，S. turgidiscabies［17-18］，S.galilaeus［19］等。本研究室的Li等［20］2019年發現生防菌B. altitudinisAMCC101304對馬鈴薯瘡痂病有良好的防治效果。本研究分離獲得一株對桃樹根腐病、馬鈴薯瘡痂病等土傳病害病原菌抑制效果明顯的生防菌株T-6，經系統鑒定后確定該菌株為解淀粉芽胞桿菌（B. amyloliquefaciens）。

生防菌在根際土壤中廣泛存在，可主動調節作物根際土壤中的微生物組分與土壤生態功能［21-22］，促進養分的吸收［23-24］，增強抗病性，提高品質［25-26］。2017年，本研究室的Chen等［21］報道生防菌Brevibacillus laterosporuAMCC100017有利于土壤中有益功能菌的增殖，可增加土壤群落中微生物多樣性。在多數情況下，芽胞桿菌的抑菌活性與其合成抗生素或其他化合物抑制或直接殺死病原生物的能力有關［27-28］。Bacillus可通過核糖體或非核糖體兩種途徑來合成抗生素、細菌素及抗菌肽等多種抗菌物質［29］。迄今為止，已揭示的芽胞桿菌生防機制有競爭、拮抗與誘導寄主抗性等內容［30］。本研究在檢測生防菌株T-6抑菌物質酶活時發現，該菌株具有產蛋白酶與幾丁質酶的活性，推測其抑菌特性與這兩種酶解能力緊密相關。通過盆栽試驗測定T-6菌株對番茄根腐病的防治效果發現，灌入生防菌T-6發酵液后的混合處理組對比單病原對照組病情指數明顯降低，防效可達54.69%。

芽胞桿菌還可通過分泌植物激素［31］或通過磷增溶、鐵還原等方式為植物提供營養來直接促進作物生長［32］。Chowdhury等［33］研究發現，解淀粉芽胞桿菌FZB42防治茄根枯萎病時，可顯著提高生菜的生物量。本研究經對T-6菌株進行促生指標測定，發現該菌株具有解磷、溶磷及解鉀的能力。在后期番茄盆栽試驗中，該菌株在CK與生防菌處理組、病原菌與病原菌+生防菌處理組以及CK與病原菌+生防菌處理組這3組比較結果中，有部分指標可達差異極顯著水平，表現出了該生防菌株顯著的促生和抗病效果。分析其原因可能是該菌株通過分泌酶類物質抑制病原菌的增殖與通過解磷和解鉀的方式為植株提供營養，從而極大地促進了番茄幼苗的生長。結合盆栽中其顯著的防治效果，說明T-6菌株確實具有一定的促生與生防潛力。

芽胞桿菌菌劑的生產，從菌株的篩選鑒定、功能驗證到后期的大田應用，需要經歷相對復雜漫長的過程［34］，這期間芽胞桿菌要受許多內在因素與外界環境的影響，因此，本試驗獲得的生防芽胞桿菌菌株還需要后期進一步的大田驗證與系統優化。

4 結論

本研究篩選出的T-6生防芽胞桿菌菌株，經形態學、Biolog生理生化和分子生物學系統鑒定，確定為B. amyloliquefaciens。該生防菌株具有一定的促生及廣譜的抗菌活性，在防治桃樹根腐病等土傳病害方面具有較大的潛力。