miRNA調控鹿茸生長發育的研究進展

韓若冰 韓 磊 湯吉偉 趙德睿 李和平

(東北林業大學野生動物與自然保護地學院，哈爾濱，150040)

鹿茸是雄性鹿科(Cervidae)動物(除馴鹿Rangifertarandus外)特有的能周期性再生的附屬器官[1]，其在快速生長期的細胞分裂速度是癌細胞的30多倍[2]?，F已有研究表明梅花鹿(Cervusnippon)鹿茸生長速度可達到12.5 mm/d[3]，馬鹿(Cervuselaphus)甚至可達到27.5 mm/d[4]。由于其具有生長速度甚至比癌細胞快卻不發生癌變的特點，鹿茸一直以來都是廣大科學家研究的重點和熱點。鹿茸的生長發育與再生受到遺傳因素、營養因素、光照、溫度、睪酮等體內激素的影響。決定鹿茸發生及再生的關鍵組織為鹿茸干細胞，與此同時，在鹿茸發生及鹿茸每年的再生過程中，均需要干細胞微環境的參與[5]。然而，利用傳統的實驗技術很難從分子水平上深入探究鹿茸生長發育的機理。隨著高通量測序技術的興起和發展，越來越多的科學家試圖運用miRNA在基因表達調控中發揮的作用來探究鹿茸獨特的生物學特性(快速生長發育和周期性再生)，以期為人類癌癥治療甚至是器官再生研究提供新的思路和見解。

microRNA(miRNA)是一類由植物、動物和一些病毒編碼的小分子單鏈非編碼RNA(-22個核苷酸)[6-9]。首次在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)中被發現，作為一種轉錄后調控因子，通過與靶mRNA的3′UTR完全或不完全互補配對在基因表達調控中發揮著重要的作用[10]，已在多種動植物體中廣泛應用[11-13]。在鹿茸生物學領域也有研究表明miRNA可以通過直接或間接的作用調控鹿茸的生長發育。本文結合已有文獻對現有microRNA調控鹿茸生長發育的研究進行了總結并且提出展望。

1 miRNA相關技術的研究概況

1.1 miRNA芯片技術的應用

對于鹿茸生長發育的研究主要有直接克隆和RT-PCR法。2004年，利用人類及鼠的特異性寡核苷酸探針的微芯片篩選miRNA的實驗證明miRNA芯片技術具有特異性強、靈敏度高和穩定性好等特點[14]。miRNA芯片技術可以用來鑒定動植物體中miRNA的存在及表達量情況，是檢測不同組織或部位間miRNA表達的重要方法[14]，運用miRNA芯片技術來了解miRNA在鹿茸生長發育中的調控作用是一種經濟而有效的方法。但現階段關于miRNA在鹿茸生物學領域(生長發育以及周期性再生)的研究報道較少。

1.2 RNA-seq測序技術的應用

隨著分子生物學的發展，高通量測序技術應運而生。RNA-seq是新一代高通量測序技術，運用這種高通量測序技術可以將組織中的RNA(mRNA，miRNA，lncRNA)全部或部分測出來，反映它們在不同組織或者細胞之間的表達水平，并且可以鑒定出組織或者細胞之間差異性表達的RNA(mRNA，miRNA，lncRNA)。其中，Small RNA-seq技術是一種運用高通量測序技術鑒定動植物體中miRNA表達量情況的方法。其主要通過測序原始數據質控、標準數據分析、miRNA家族分析、miRNA靶基因預測和靶基因GO、KEGG富集分析等對組織內所有miRNA進行測序和表達定量。從而進一步探究其在動植物體中發揮的調控作用。隨著small RNA-seq測序技術的日益發展，miRNA在鹿茸生長發育中的研究也取得了一定的突破和進展。

2 miRNA在鹿茸中的研究進展

2.1 鹿茸組織中miRNA的鑒定

利用miRNA芯片技術對鹿茸組織中miRNA進行鑒定的相關報道較少。目前主要有對于馬鹿和梅花鹿miRNA的相關研究，對于其他的鹿科動物還少有涉及。崔東明等[15]對鹿茸間充質細胞和軟骨細胞進行了miRNA鑒定并進行了差異表達分析。通過培養鹿茸間充質細胞及軟骨細胞、制備鹿茸頂端間充質及軟骨組織miRNA芯片、芯片雜交及數據分析，最終得到鹿茸間充質部位的miRNA 289條(117個miRNA表達上調，71個miRNA表達下調)，軟骨部位存在的miRNA 304條(97個miRNA表達上調，87個miRNA表達下調)。其中，軟骨組織和間充質組織中差異表達的miRNA有158條。通過miRNA芯片技術鑒定鹿茸頂端組織中的miRNA為將來miRNA在鹿茸生長發育中的研究提供了重要的數據參考基礎。

Chen等[16]鑒定了馬鹿軟骨組織中保守的miRNA和新的miRNA。最終在馬鹿軟骨組織中鑒定出399個miRNA，其中345個為高度保守的miRNA，54個為鹿茸軟骨組織特有的miRNA，為馬鹿鹿茸的生物學研究以及再生鹿茸軟骨組織中miRNA的研究提供了參考。Ba等[17]通過高通量測序技術對梅花鹿增茸期和休眠期的骨膜干細胞進行miRNA測序，鑒定得到2個時期的差異表達miRNA，其中8個miRNA表達顯著下調，6個miRNA表達顯著上調。鑒定出20種保守的鹿茸特有的miRNA。通過對靶基因進行GO和KEGG富集分析，結果表明Wnt、MAPK和TGF-beta信號通路可能是鹿茸再生過程中必不可少的信號通路，但是這些信號通路在鹿茸再生的過程中如何發揮調控作用需要進一步的實驗來證明。

2.2 miRNA對生長因子的調控作用

多種生長因子及其受體在鹿茸的生長發育過程中均發揮著重要的調控作用。如：表皮生長因子(EGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、轉化生長因子(TGF)、血管內皮生長因子(VEGF)等。隨著后續研究的深入，對于這幾種生長因子在鹿茸生長發育過程中的功能以及在鹿茸頂端組織中的表達量情況已有相關研究。目前miRNA對VEGF、TGF、IGF發揮的調控作用以及對鹿茸細胞增殖產生的影響也開展了相關研究。

血管內皮生長因子(VEGF)主要存在于鹿茸頂端組織的前成軟骨層及軟骨層，并且對于鹿茸軟骨內血管的形成具有一定的作用[18]。李璐[19]通過實驗證實VEGF是miRNA-93-5P與miRNA-20b-5p調控的靶基因，轉染實驗證明miRNA-93-5P與miRNA-20b-5p的過表達能抑制鹿茸軟骨細胞的正常生長發育。還證明了梅花鹿軟骨細胞中VEGF的表達與bFGF、IGF的表達存在一定的關聯性。這些生長因子之間可能存在著某種相互作用，從而共同調節著梅花鹿鹿茸的生長發育。然而生長因子如何通過相互作用來調節鹿茸生長發育還尚未被揭示。另有研究表明miRNA-15a和miRNA-15b是鹿茸VEGFR的新調控因子[20]，它們抑制鹿茸軟骨細胞的增殖。TGF-B是一類多功能的生長因子，在調節細胞生長、分化等方面具有一定的作用[21]。鹿茸頂端組織的5個層中均具有TGF-B1的表達，但其表達量不盡相同。TGF-B可與Wnt信號通路共同作用使細胞維持在間充質細胞的狀態。韓香玉[21]通過Hiseq深度測序、qPCR和雙熒光素酶活性檢測證實了miRNA-148a-3p靶向調控TGF-B2基因，同時，利用MTT法表明miRNA-148a-3p對鹿茸軟骨細胞體外增殖活性有一定的抑制作用。轉染miRNA-148a-3p后TGF-B2、TGF-βRⅡ和IGF-1蛋白的表達水平有所下降，證明這三者之間存在一定的關聯性。這也印證了李璐[19]的實驗，說明不同的生長因子之間可能存在著某種聯系，它們共同作用調節鹿茸的生長發育。

2.3 miRNA對鹿茸細胞增殖的作用

隨著高通量測序技術的迅速發展，應用small RNA-seq技術對鹿茸生長發育進行的研究越來越多。Yao等[22]分析了鹿茸生長發育過程中miRNA的表達量，其中12個基因在鹿茸的快速生長期表達量顯著升高(Fn1，Sox9，Col2a1，Acan，Col9a1，Col11a1，Hapln1，Wwp2，Fgfr3，Comp，Sp7 和 Ihh)，該研究還發現了一些miRNA和基因共同作用參與了軟骨形成和軟骨內成骨的過程。比如：miR-3072-5p，miR-1600，miR-34-5p，miR-6889-5p和 miR-6729-5p。最終通過比較鹿茸生長中心的快速生長期和初期生長期，構建了miRNA-mRNA調控網絡。對于將來鹿茸發育過程中miRNA和靶基因、不同miRNA之間以及不同基因之間的研究具有重要的意義。Hu等[23]通過對鹿茸重量存在差異的100個個體的鹿茸尖部增殖區進行高通量測序，共鑒定出1 082個miRNA，鑒定得到一些基因(COL1A1，COL1A2，COL3A1，FN1和ATP6)和一些miRNA(miR-21，let-7i和 miR-27b)與鹿茸的生理生長特性高度相關。該研究最終篩選得到可以作為鹿茸重量DNA標記的14個候選基因和6個候選miRNA，并且構建了關于鹿茸生長發育的miRNA-mRNA調控網絡，該研究對從分子水平上揭示鹿茸重量的不同具有一定的參考基礎。孟星宇[24]在制備鹿茸軟骨細胞和間充質細胞的miRNA芯片基礎上，運用實驗證明miR-1對鹿茸軟骨細胞增殖有明顯的抑制作用，S期細胞含量明顯減少，G0/G1期細胞含量明顯增加。李婷等[25]通過雙熒光素酶報告基因檢測實驗確定了let-7a、let-7f是IGF-1R基因的靶基因，并且證實let-7a、let-7f對鹿茸頂端組織的軟骨細胞增殖具有抑制作用，而let-7a、let-7f的抑制物可以通過上調細胞內IGF-1R的表達量進而使細胞增殖速度加快。Hu等[26]驗證確定了miR-18a是鹿茸增殖的重要調控因子，且可以顯著抑制鹿茸軟骨細胞的增殖。對于miRNA對鹿茸細胞增殖影響的研究，填補了RNA組學在鹿茸生物學中運用的數據，為鹿茸生長發育的進一步揭示提供了參考。

2.4 miRNA對鹿茸再生調控的研究進展

鹿茸的周期性再生是一個復雜的過程，伴隨著皮膚、血管、神經和骨組織等組織的再生。目前對于miRNA在鹿茸再生的過程中發揮怎樣的作用還未見詳細的報道。Runx2在軟骨細胞分化和成熟過程中起重要作用，Runx2可能在梅花鹿鹿茸再生的過程中扮演著重要的角色[27]，而miRNA-27a可以通過下調Runx2的激活劑進而抑制Runx2的表達[28]。由此可見miRNA-27a是鹿茸再生過程中一個重要的miRNA，可能通過調控鹿茸軟骨組織的再生進而調控鹿茸的整個再生過程。鹿茸的再生屬于割處再生，茸角傷口愈合而不留瘢痕。在大鼠傷口中局部使用miRNA-29b治療可以減少傷口愈合過程中瘢痕的形成，這提示我們miRNA-29b可能在鹿茸割處再生的過程中也發揮著不可或缺的作用[29]。但是對于miRNA在鹿茸再生中發揮的具體作用還需要進一步的實驗來闡明。

3 總結與展望

鹿茸生長發育以及周期性再生的相關研究一直以來都是眾多學者研究的重點和熱點。鹿茸再生由內部組織(軟骨和骨)和外部組織(皮膚、血管和神經)所構成，鹿茸的生長發育是一個復雜的過程，在這個過程中，鹿茸的骨組織、皮膚、血管、神經等組織均在生長。眾多細胞因子之間通過相互作用協同調節鹿茸生長發育。探究miRNA對于鹿茸生長發育的作用有助于我們從RNA組學的角度了解鹿茸的生長發育，這無疑加速了人們對鹿茸生長發育獨特生理學特點的認知。

綜上所述，目前對于miRNA通過介導生長因子進而調控鹿茸生長發育的研究主要集中在對VEGF、IGF和TGF這3個生長因子的研究上，對于miRNA如何靶向其他的生長因子以及對鹿茸的生長發育發揮怎樣的作用和影響等方面尚未見報道。Yao[22]等構建的鹿茸生長中心的miRNA-mRNA調控網絡是一個復雜的調控網絡，對于其中不同基因之間、不同miRNA之間、miRNA與它的靶基因之間通過什么樣的競爭和協作關系來調控鹿茸生長發育我們尚未了解。對于這個龐大而又復雜的調控網絡也知之甚少。同時，由于現有鹿科動物的基因組比較匱乏，使得鹿科動物的研究具有一定的局限性。在接下來的研究中，應結合RNA組學不斷探索miRNA的調控機制以及對鹿茸生長發育甚至是再生的作用，這將為鹿茸生長發育甚至是人類腫瘤治療以及器官再生提供重要的參考依據。