非洲豬瘟病毒分子生物學檢測方法研究進展

李天芝，于新友

（山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

非洲豬瘟病毒（ASFV）屬非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬病毒。病毒粒子有囊膜，大小約175～215 nm，只有1個血清型。ASFV為線狀雙鏈DNA病毒，基因組大小170～190 kb，兩端為可變區，中間為保守中心，包含ORF150個，可編碼150～200種蛋白，其中結構蛋白28種[1]。根據P72基因序列的差異，可分為24種不同的基因型，中國流行的主要是基因Ⅱ型。病毒對外界環境抵抗力強，尤其在濕冷環境可長期存活。ASFV宿主范圍較窄，僅感染豬致其發生非洲豬瘟（ASF），該病是一種高度接觸性傳染病，以高熱、厭食、皮膚發紺、內臟器官廣泛出血及高死亡率為特征[2]，但通常傳播速度慢。世界動物衛生組織（OIE）規定ASF為必須通報的動物傳染病，中國則將其定為一類動物疫病[3-4]。ASFV感染豬只后可在其體內大量增殖，但抗體產生速度較慢，且一般不產生中和抗體。

自2018年8月ASF首次報道以來，迅速席卷我國，不僅給養豬業造成嚴重的經濟損失，還造成重大的經濟、社會和政治影響[5-6]。目前尚無有效的商品化疫苗可用，也無有效治療藥物。其所引起的病變與豬瘟及細菌性敗血病等病變類似，因此，僅通過剖檢有時很難做出正確診斷，需借助實驗室方法確診?？贵w檢測存在一定的缺陷，抗體產生的滯后性和抗體檢測不能判定現癥感染，故一般采取病原學方法進行確診。由于方法本身局限性及國家相關政策等影響，傳統的病原分離，間接免疫熒光滿足不了臨床樣本檢測的需求，針對ASFV核酸的分子生物檢測方法是最適宜該病檢測方法。該病防控主要依靠撲殺感染動物、完善的生物安全措施，為滿足現場早期、快速、準確排查ASF疫情，阻止疫情在國內的進一步蔓延的需求，需借助先進、科學、經濟的分子生物學檢測方法。本文闡述ASFV的分子生物學檢測方法研究進展情況，為ASF的診斷及防控工作提供參考。

1 核酸探針

核酸探針又稱核酸雜交，利用核苷酸堿基順序互補的原理，用能特異性識別堿基序列（靶序列）一段單鏈DNA（或RNA）分子作標記，與被測定的靶序列互補，以檢測被測靶序列的技術。張鑫宇等對22株發表的非洲豬瘟病毒（ASFV）p72基因序列進行比較，根據保守的基因序列，各設計、合成1條與保守區域互補的5'生物素標記及3'烷巰基修飾短鏈寡核苷酸探針，并將烷巰基修飾的探針吸附到納米金顆粒上，制備納米金標記探針，PCR擴增出的p72基因中的651 bp保守核酸序列，變性后與上述生物素探針及標記納米金探針進行雜交，雜交產物加入吸附鏈霉親和素的酶標板，利用親和原理，捕獲雜交產物，銀染增強法對納米金標記探針進行信號放大，結果表明，制備的納米金探針經銀染放大后，在酶標板中形成肉眼可見的黑色沉淀，可實現有效檢測ASFV p72擴增基因，對核酸檢測敏感度為10 fmol·L-1[7]。

2 納米PCR

納米PCR技術是將納米材料應用PCR所形成的一門新興技術，納米金粒子的應用可提高酶的活性和穩定性，改善非特異性擴增現象，提高PCR檢測特異性，縮短PCR反應時間，檢測敏感性是常規PCR的100倍，使檢測更加準確、可靠[8]。崔尚金等建立了ASFV的高效納米PCR檢測方法，該方法采用納米金顆粒作為熱導介子，提高了PCR反應效率，采用該方法同時檢測ASFV、大腸桿菌、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環病毒2型（PCV2）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬捷申病毒、豬腦心肌炎病毒等，結果只有ASFV能夠擴增出552 bp的目的片段[9]。敏感性實驗表明，納米PCR檢測技術是常規PCR檢測技術敏感性的1 000倍以上，最低核酸拷貝數檢出量可以達到10個拷貝。

3 多重PCR法

多重PCR是一種特殊的PCR技術，在同一PCR體系中，加入多對引物，同時檢測2種或2種以上的病毒DNA，具有快速、靈敏度高、高效、特異性強等優點而廣泛用于臨床的快速診斷。任梅滲等參考PRV、CSFV、ASFV、PRRSV、副豬嗜血桿菌（HPS）、胸膜肺炎放線桿菌（APP）以及多殺性巴氏桿菌（PM）標準毒株序列，選擇各病毒和細菌的保守序列分別設計7對特異性引物進行多重PCR，各項優化試驗結果表明，當反應的退火溫度為51℃，各條引物濃度均為0.8 μmol·L-1時擴增的目的條帶效果最佳，用敏感性試驗檢測該反應中各病毒的最小檢出量分別為：1.01×102（PRV）、1.48×103（CSFV）、1.07×104（ASFV）、9.73×103（PRRSV）、1.82×103（HPS）、1.65×103（PM）和 3.64×103（APP）copies·μL-1，在最優化的反應條件下進行特異性試驗，結果未出現交叉反應，能檢出對應病原的多種血清型，陰性對照均無非特異性擴增[10]。冷依伊等根據GenBank中登錄的ASFV、水皰性口炎病毒（VSV）、豬口蹄疫病毒（FMDV）、CSFV以及PRV參考病毒株序列，選擇各病毒的保守序列設計5對特異性引物，通過優化反應條件，建立了一種可以同時快速檢測以上5種病毒的多重PCR檢測方法，結果顯示，該方法對不同的細菌或病毒模板擴增結果均為陰性，特異性強，敏感性試驗表明該方法對PRV、CSFV、ASFV、VSV和FMDV的核酸最少檢出量分別為 8.82×103、6.87×104、5.71、4.93×104和4.32×102copies·μL-1，以上結果表明該方法快速、靈敏、特異性強[11]。

4 熒光定量PCR

熒光定量PCR（qPCR）融匯了傳統PCR技術靈敏、快速、特異的特點以及光譜技術的高敏感性和高精確定量的優點，檢測速度快、敏感高，可直接觀察擴增結果，不需要后續電泳檢測擴增產物，減少了對環境氣溶膠污染的可能，避免了假陽性結果。據信號基團的不同，qPCR可以分為染料法和探針法兩種。曾少靈等依據ASFV較保守的VP73基因序列，設計特異性引物與探針，建立了ASFV實時熒光PCR檢測方法，并與OIE推薦用于檢測ASFV的實時熒光PCR和普通PCR方法進行比對，結果顯示，該法檢測靈敏度與OIE熒光PCR方法相當，但比普通PCR方法高出至少10倍。該法最低檢測限可達10 copies·μL-1病毒DNA，該法重復性和穩定性好，批內CV值為0.61%～1.14%，批間CV值為1.37%～3.14%[12]。王建華等根據ASFV CP530R基因序列設計1對特異性引物和探針，通過優化反應條件，建立了一種檢測ASFV的Taq-Man-MGB探針實時熒光PCR方法，并對該方法進行了特異性、定量線性范圍、敏感性和重復性等試驗評價，結果表明，該方法僅對ASFV發生特異性擴增反應，不與PRV、豬細小病毒（PPV）和PCV2、CSFV、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、PRRSV和豬流感病毒（SIV）發生交叉反應，具有良好的特異性。用該方法檢測質粒標準對照的線性范圍為6.1×102～6.1×109copies·μL-1，標準曲線方程為y=-3.449x+38.10，相關系數（R2）為0.999，最低可檢測到61個拷貝的質粒標準對照分子，對5個不同濃度的質粒標準對照進行雙份樣品的4次重復檢測，每個濃度質粒標準對照的Ct值變異系數均小于2.0%，具有良好的重現性[13]。王建華等根據ASFV CP530R基因、CSFV 5'UTR基因和高致病性PRRSV NSP2基因，分別設計3對引物和TaqMan探針，建立了能同時檢測這3種病毒的多重熒光定量RT-PCR方法，結果表明，該方法僅對ASFV、CSFV和HPPRRSV呈現特異性擴增，不與PRV、PPV和PCV2的DNA以及PEDV和SIV的cDNA發生交叉反應，該方法對ASFV、CSFV和高致病性PRRSV的最低檢出量分別為61、11和41 copies·μL-1，組內和組間重復性試驗的Ct值變異系數均＜2.5%，具有良好的重現性[14]。

5 微滴數字PCR

微滴數字PCR（ddPCR）是第三代PCR技術，其原理是通過油包水技術將預混的PCR體系分割成數萬個納米級微滴，每個微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個至數個待檢核酸靶分子，作為一個獨立的擴增體系，通過熒光檢測每個微滴中的陽性微滴數和陰性微滴數[15]。根據泊松分布的原理以及出現熒光信號的微滴個數與比例，即可得出靶分子的起始濃度，從而實現靶分子的絕對定量[16]。不再需要標準曲線，不依賴Ct值或內參基因，可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數目，精確性更高。鄔旭龍等針對ASFV K205R基因設計一對特異性引物和Taq Man探針，通過反應條件優化，建立了ASFVqPCR和ddPCR檢測方法，并對兩種方法的線性關系、靈敏性、特異性和重復性進行了評估，利用建立的ASFV檢測方法對163份我國內和進境的組織樣本及血清樣本進行檢測，血清樣本經商品化ASFV ELISA試劑盒復檢，評估不同方法檢測結果的符合率，結果顯示，建立的ASFV qPCR和dd PCR檢測方法線性關系較好（R2≥0.998），ddPCR的最低檢測限度可達到0.36 copies，在20 μL反應體系中約為10拷貝/反應，檢測靈敏度是qPCR的10倍[17]。ASFV ddPCR檢測方法具有很高的特異性和重復性，不與其他豬常見病毒發生交叉反應。

6 環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增（LAMP）方法是日本學者Notomi等發明的一種新的適用于基因診斷的恒溫核酸擴增技術，不需要復雜的儀器設備，一臺水浴鍋或恒溫箱就能實現反應，結果可通過肉眼觀察白色渾濁或綠色熒光的生成來判斷，簡便快捷，具有靈敏度高、操作簡單、反應時間短、臨床使用不需要特殊的儀器等優點，特別適合在現場和基層部門應用。王華等通過對GenBank中ASFV p72蛋白基因序列進行分析，設計合成了內（FIP，BIP）、外（F3，B3）兩對引物，通過對反應條件進行優化，建立了非洲豬瘟LAMP檢測方法，結果顯示，該方法在62℃恒溫60 min即可完成，最低可檢測到1×101copies·μL-1的病毒DNA，與常規PCR方法相比靈敏度高100倍，對ASFV、PCV2、PPV、PRV基因組DNA同時檢測，結果僅有ASFV出現條帶，而其他均未出現目的條帶[18]。田純見等根據ASFV高度保守的非結構DNA聚合酶G1211R基因設計引物，建立了ASFV實時熒光LAMP方法，并與熒光PCR檢測結果進行比對，結果顯示，該法檢測靈敏度達21 pg，優于熒光定量PCR方法，重復性實驗LAMP檢測批內和批間變異系數均＜5%，該法特異性良好，與PCV2、PRV、CSDFV、PRRSV及昆蟲核酸無交叉反應[19]。還有一種檢測ASFV的LAMP擴增方法。該方法能在58℃恒溫條件下50 min內完成檢測反應，敏感性實驗表明，最低可檢出5 copies·μL-1的ASFV核酸，該法與健康豬樣本、PRRSV和PPV核酸樣本不發生交叉反應，特異性強。所建立的檢測方法反應結束后，無需開蓋，可避免氣溶膠造成的污染。通過肉眼觀察反應液顏色變化判讀結果，若反應液呈黃色，結果判為陽性，若反應液呈橙紅色，結果判為陰性。

7 重組聚合酶擴增技術

重組酶聚合酶擴增（RPA）技術是2006年由英國公司TwistDx Inc研發的一種核酸擴增技術[20]。該法利用重組酶、具有聚合鏈置換功能的DNA聚合酶、單鏈結合蛋白等三種酶代替了傳統PCR的熱循環解鏈過程，25～42℃等溫條件下，30 min內實現對靶基因的指數級擴增，不需要昂貴的儀器設備，產物的檢測可通過凝膠電泳、熒光檢測儀、側向流試紙條（LFD）、生物芯片等多種不同方法，具有靈敏度高、特異性強、檢測時間短、結果讀取多元化、操作簡便等優點，能滿足疫病快速現場檢測的需求[21]。王建昌等根據ASFV P72基因序列，設計引物，建立了一種檢測ASFV的RPA等溫擴增方法，結果表明，該法在38℃水浴鍋中恒溫反應30 min，即可實現對目的片段的有效擴增，以包含ASFV P72基因的ORF質粒為模板，RPA的檢測限達到102copies，同OIE推薦的熒光PCR法最低檢測限一致，該法僅特異性擴增ASFV P72基因，對口蹄疫病毒（FMDV）、CSFV、PRRSV、PRV和PCV2基因組c DNA或DNA沒有擴增[22]。哈登楚日亞等針對ASFV p72基因設計了3組引物和探針，通過不斷優化反應條件，建立了ASFV實時熒光RPA檢測方法，結果顯示，該法在39℃恒溫條件下20 min內可完成檢測反應，最低可檢測10個copies的DNA分子，且與CSFV、PCV2、PPV、PRV均無交叉反應，檢測5.5×106～5.5×100copies·μL-1共7個稀釋度樣品在各時間點的熒光強度，變異系數范圍在0.38%～28.30%[23]?？姲l明等建立了一種簡便、快捷的現地檢測ASFV的方法，該法聯合RPA和LFD技術，針對ASFV P72基因保守區域，設計兩條引物和一條nfo探針，下游引物5'端標記生物素，nfo探針5'端異硫氰酸熒光素或6-羧基熒光素，3'端帶有阻斷物，序列內部標記THF分子，通過引物濃度、RPA反應時間和溫度等條件的優化建立了一種可以用于ASFV現地檢測的RPA-LFD方法。該檢測方法在38～46℃恒溫反應10 min即可實現對ASF目的基因的有效擴增與CSFV、PCV2、豬乙型腦炎病毒（JEV）、PEDV、PRRSV、PRV等均無交叉反應，RPA擴增產物直接用LFD肉眼觀察，最低檢測限為102拷貝/反應，靈敏度與TaqMan熒光定量PCR相當[24]。

8小結

非洲豬瘟是國際公認對養豬業危害最嚴重的疾病，世界各國均高度重視，豬場一旦發病，按國家政策應全群撲殺。目前該病在全國均有流行，給養豬業造成毀滅性打擊，使養豬人喪失養豬信心。中國是以散戶為主的養殖模式，居民普遍喜食鮮肉，大規模生豬調運，注定非洲豬瘟的防控工作必將是一場持久戰。雖然該病已流行近百年，但對其致病機理尚不明確，因病原獨特性質，疫苗研究未取得突破性進展，甚至消毒劑及診斷制品的研究還不完善，還有大量工作要做。該病雖然全國范圍多點散發，但傳播速度非常慢，早期診斷后，通過相應的消毒及生物安全防控措施可將豬場損失降低。為開展非洲豬瘟分子流行病學調查，了解病毒傳播途徑，掌握疾病流行動態，防止疫情擴散和蔓延，需依靠大量快速、敏感、成本低、操作簡單的高質量檢測試劑。

當前ASFV分子生物學檢測方法有多種，但各有利弊，探針檢測法雖然可實現高通量檢測，一次可檢測大量樣本，但操作較復雜。納米PCR方法雖然檢測速度快、敏感性高、特異性強，但不能實現對病原的定量檢測，且納米材料不易獲得。多重PCR方法雖然可實現對多種疾病的快速篩查，但因所用引物眾多，反應條件很難兼顧，致檢測敏感性不高，易導致漏檢。熒光PCR檢測方法較成熟，檢測速度快，可實現病原定量檢測，但染料法特異性不好，很難篩選到好的引物，探針法探針合成價格較貴，且需要價格昂貴的儀器設備，很難在基層大面積推廣應用。LAMP方法雖然簡單、方便，適合基層進行推廣應用，但引物設計復雜，且靈敏度太高，易出現假陽性結果，對非特異性擴增也很難鑒別。微滴數字PCR探針的設計同熒光PCR，原理復雜，操作對人員要求高，無需標準曲線，最低可檢測單拷貝核酸分子，可實現待檢靶樣品核酸絕對定量，目前普及程度不如熒光PCR，同樣不適合基層檢測。重組聚合酶擴增技術所用試劑價格昂貴，檢測成本高，引物設計規則不明。

當前對ASF無有效疫苗和治療藥物可用，只能靠嚴格的生物安全措施防控，制定嚴格標準，并嚴格執行，規范引種與賣豬流程，進出車輛嚴格消毒。人員按規定隔離、消毒和換洗衣物。加強豬飼養管理，提供適宜溫度、濕度，降低豬只飼養密度，豬舍分割成小單元飼養，減少豬群應激。進出豬場飼料、藥品、疫苗、物資等嚴格熏蒸消毒，豬舍定期清理糞尿，做好滅蚊蠅及滅鼠工作。選擇質量有保證的廠家對ASFV有確定效果的消毒劑，如過硫酸鉀復合物、戊二醛等，消毒劑配制濃度要合理，保證消毒時間，并注意外界環境溫度，部分消毒劑在低溫環境無效。

因中國流行的ASFV為強毒株，豬群常在抗體還未產生或抗體滴度不高時豬只已死亡，全球對非瘟都是撲殺政策，所以當前檢測抗體的意義并不大，主要針對抗原檢測。隨著疾病的流行，ASFV可能會變為弱毒株，豬只出現隱性帶毒情況，到時檢測抗體可能更有意義。雖然針對ASFV病原檢測方法有多種，但當前國家推薦的檢測方法是熒光PCR，國家農業部組織了比對，推薦了一些質量符合要求的廠家。檢測時可選取全血、血清、唾液、糞便、扁桃體、淋巴結、脾臟等樣本，通常唾液中最早出現病毒，適合疾病早期篩查，一定要把握檢測時間，早發現，早剔除，減少豬舍中病原載量，否則可能就沒有意義。另外對檢測的唾液樣品最好不離心、不凍融，盡早檢測，以提高檢出率，否則可能會因核酸降解及病毒量減少造成漏檢?；铙w檢測排查病原是可采集血樣，采樣時一定要防止豬只見交叉污染，全血的檢出率要高于血清。雖然公認病豬脾臟為檢測的最佳組織，但一般不建議對疑似發病豬只解剖，以免造成大的污染面，可在腹股溝淋巴結切開一小口，取少量淋巴結檢測。如果條件允許的話不要選擇免核酸提取試劑盒，免核酸提取試劑盒雖然對病毒含量高的樣本擴增無影響，但對環境采樣或對病毒含量低的樣本，少了核酸的富集和純化過程，必然會減少樣本陽性檢出率。核酸手提法操作繁瑣，時間長，對人員和儀器設備要求高，商品化核酸提取試劑盒分為柱式提取法和磁珠提取法兩種，磁珠法更適合大量樣本用核酸自動提取儀提取，不同廠家柱式法試劑提取效率不同。便攜式熒光檢測試劑及適合常溫保存和運輸的試劑在基層疾病的診斷中必將發揮巨大的作用。

隨著技術的不斷進步，科研工作者一定會開發出更多價廉、質優的檢測試劑，以滿足基層豬場及實驗室檢測需求，從而更好地防控非瘟，減少豬場損失，保障養豬業的健康發展。