5種常綠杜鵑組杜鵑雜交親和性及播種繁殖研究

李曉花，童 俊，王凱紅，李丹丹，單 文，王兆紅，張樂華*

(1.江西省中國科學院廬山植物園，江西 廬山 332900； 2.武漢市農業科學院 武漢 430065)

在自然條件下，杜鵑花屬(Rhododendron)植物存在從同種不同基因型之間到同亞屬中不同亞組之間的雜交現象[1-2].雜交育種是目前國內外杜鵑花育種中應用最廣泛、成效最顯著的育種方法.張長芹等[3]開展了59種杜鵑花屬植物雜交育種研究，發現常綠杜鵑組的大白杜鵑(R.decorum)×桃葉杜鵑(R.annae)、馬纓杜鵑(R.delavayi)×大白杜鵑、桃葉杜鵑×馬纓杜鵑的坐果率均在60%以上；并發現同亞屬間雜交親和力強，不同亞屬間雜交不育.耿興敏等[4-5]研究發現同亞屬的杜鵑雜交親和性較強，不同亞屬間雜交存在生殖障礙、親和性弱，而延遲授粉、3%食鹽水或花粉培養液涂抹柱頭、加熱花粉等方法能有效克服亞屬間遠緣雜交授粉障礙，提高結實率和蒴果種子數及千粒重.莊平[6]研究了杜鵑花屬植物種間雜交的向性，發現相同物種的正反交其結實率存在明顯差異[7].國外大量的研究表明，杜鵑花屬植物類群(亞屬、組及亞組)的種間雜交有3種育性表現，雙向可育，如映山紅亞屬(Subgen.Tsutsusi)×杜鵑亞屬(Subgen.Rhodoendron)；單向不育，如映山紅亞屬×常綠杜鵑亞屬(Subgen.Hymenanthes)；雙向不育，如羊躑躅亞屬(Subgen.Pentanthera)×映山紅亞屬[8-10].莊平在常綠杜鵑亞屬內、杜鵑亞屬內及不同亞屬間的種間雜交中也發現不同程度的單向不育現象[2，6，11-12]；Ma等[13]研究證實，常綠杜鵑組的蜜腺杜鵑亞組(subsect.Thomsonia)的藍果杜鵑(R.cyanocarpum)與同組不同亞組的馬纓杜鵑存在自然雜交現象，并能進行不對稱的雙向交配；Hirao[14]采用微衛星標記技術研究發現，與遠距離的植株間人工授粉相比，近距離授粉會導致R.brachycarpum有效基因流減少、后代繁殖力(種子發芽率、幼苗成活率)及適應性下降.

現有的資料顯示，有關杜鵑花可育性的研究主要見于歐、美、日、澳等發達國家和地區，而國內杜鵑雜交育種起步晚，工作十分有限[4，15-16]，特別是缺乏對雜交種子的萌發與幼苗生長狀況的跟蹤研究.為探索常綠杜鵑組亞組間雜交可育性及其規律，本文以5種常綠杜鵑組(Sect.ponticum)杜鵑為材料，通過人工雜交授粉實驗研究了其種間雜交的親和性，并以坐果率、萌發率、綠苗率為指標對其可育性進行了綜合評價，以期為我國杜鵑花雜交育種提供依據.

1 材料與方法

1.1 材料

以廬山植物園引種栽培的常綠杜鵑組(Sect.Ponticum)杜鵑為材料，共計4亞組、5種，分別是云錦杜鵑亞組(Subsect.Fortunea)的井岡山杜鵑(R.jinggangshanicum)、喇叭杜鵑(R.discolor)，耳葉杜鵑亞組(Subsect.Auriculata)的耳葉杜鵑(R.auriculatum)，銀葉杜鵑亞組(Subsect.Argyrophylla)的皺葉杜鵑(R.denudatum)及樹形杜鵑亞組(Subsect.Arborea)的馬纓杜鵑.

1.2 方法

1.2.1 雜交組合設計 采用亞組間的正反交試驗設計，共6個雜交組合(見表1).

表1 6個杜鵑雜交組合授粉實驗的結果Tab.1 Results of pollination experiments on 6 cross combinations of Rhododendron

1.2.2 試驗方法 人工授粉試驗于2018年4月～7月在廬山植物園杜鵑園中進行.花蕾開放前2 d小心去除雄蕊、套袋，待柱頭充滿黏液后授粉；在雜交前1 d，采集相應雜交組合即將開放的父本花蕾放入常溫玻璃瓶內，在晴天早上8∶00～12∶00取父本花粉進行人工授粉、套袋并掛牌.各雜交組合授粉數量不少于27朵，10 d后去除套袋使蒴果自然發育，10月底至11月授粉蒴果由棕黃色變褐色且蒴果頂部稍稍開裂時采收蒴果.

1.2.3 種子千粒重稱量 將采收的雜交蒴果和母本自然授粉蒴果置于室內自然晾干，待蒴果自然開裂后取出種子.每個組合5份、每份200粒，用分析天平(Sartorius BSA224S-CW)稱量，求平均值換算成千粒重.

1.2.4 種子萌發率、綠苗率統計 播種繁殖試驗于2019年4月30日在杜鵑花繁殖溫室內進行.泥瓦盆播種；播種基質為經福爾馬林消毒后的腐殖土+珍珠巖+蛭石(3∶1∶1，V/V/V)混合基質；基質上盆后在表層鋪設一層薄薄的洗凈、剪碎的活體苔蘚，輕壓使苔蘚與混合基質粘合；再將種子均勻撒播在苔蘚上，噴水使基質完全浸透，最后用透明的塑料薄膜覆蓋保濕.35 d后子葉展開，統計種子萌發數；65 d時統計幼苗的綠苗數.每個組合重復5次，取平均值.

1.2.5 數據處理 2018年10月～11月，蒴果成熟期統計坐果率(Capsul set，簡稱St) (%)=(坐果數/授粉花朵數)×100%；2019年6月上旬，統計種子萌發率(Germination rate，簡稱Gr) (%)=(5次重復萌發數之和/1000或實際播種種子數量之和)×100%；2019年7月上旬，統計綠苗率(Green seeding rate，簡稱Gs) (%)=(5次重復綠苗數之和/5次重復萌發幼苗數之和)×100%[17-18].采用SPSS 17軟件對所得試驗數據進行單因素比較(Duncan檢驗)，設P=0.05.

1.2.6 指標體系與等級劃分 參照莊平的方法[18]進行各指標等級劃分并進行改進(表2).1) 坐果率(St)為植物育性適應或適合度的常用指標，劃分為3個等級：0≤低<20、20≤中<60、高≥60；2) 萌發率(Gr)為種子生活力常用指標，常結合綠苗率用以分析可育性，劃分為3個等級：0≤低<15、15≤中<50、高≥50；3) 綠苗率(Gs)也為種子生活力常用指標，常結合發芽率、黃化率用以分析可育性，劃分為3個等級：0≤低<10、10≤中<60、高≥60.考慮到單一指標的不完整性和片面性以及不同指標的重要性差異，賦予上述指標的權重和等級分值，累加后求出可育性值，對各雜交組合的可育性進行綜合評價.設總權重(最高分值)為10分，綠苗率是主要可育性指標，給定其最高權重5分；其次為種子萌發率，給定最高權重3分；坐果率給定最高權重2分.各指標等級和權重分值分配方案見表1.單項得分之和為各雜交組合的總分值，依據總分值將可育性劃分為4個等級，即0≤不育<4、4≤低<6、6≤中<8、高≥8，對應類型分別為不育型、弱育型、可育型和高育型.

表2 杜鵑花雜交育種可育性指標等級與權重分配Tab.2 Fertile index grade and their weight allocation of cross breeding of Rhododendron

2 結果與分析

2.1 各雜交組合坐果率比較

2.2 母本和各雜交組合種子千粒重比較

由表1可見，5種杜鵑親本自然授粉結實種子的千粒重由重至輕依次為井岡山杜鵑、耳葉杜鵑、皺葉杜鵑、馬纓杜鵑和喇叭杜鵑，分別為362、291、234、158、120 mg.方差分析表明，除井岡山杜鵑種子千粒重顯著大于其他杜鵑外，其他4種杜鵑間無顯著差異.

2.3 母本和各雜交組合萌發率及綠苗率比較

2.3.1 萌發率比較 5種杜鵑親本自然結實種子的萌發率由高至低依次為井岡山杜鵑、耳葉杜鵑、皺葉杜鵑、馬纓杜鵑和喇叭杜鵑，分別為59.30%、48.20%、18.70%、8.80%和6.50%(見表2).方差分析表明，井岡山杜鵑與耳葉杜鵑種子萌發率無顯著差異，但兩者顯著高于其他3個物種；皺葉杜鵑種子萌發率居中；馬纓杜鵑和喇叭杜鵑種子萌發率無顯著差異但顯著低于其他3個物種.

2.3.2 綠苗率比較 綠苗率是種間雜交可育性的重要指標，種子活力越強、綠苗率越高.5種杜鵑親本自然結實種子苗的綠苗率由高至低依次為的皺葉杜鵑、喇叭杜鵑、馬纓杜鵑、耳葉杜鵑和井岡山杜鵑，分別為100%、92.36%、90.91%、84.02%和58.52%(表1).方差分析表明，皺葉杜鵑綠苗率顯著高于其他4種杜鵑，而喇叭杜鵑、馬纓杜鵑、耳葉杜鵑之間差異不顯著，但三者顯著高于井岡山杜鵑.

圖1 6個杜鵑雜交組合坐果率、萌發率與綠苗率Fig.1 Capsul set，germination rate and green seedling rate on 6 cross combinations of Rhododendron

2.4 各雜交組合可育性綜合評價

圖2 6個杜鵑雜交組合可育性綜合評價Fig.2 Fertility assessment on 6 cross combinations of Rhododendron

3 討論與結論

杜鵑花屬植物自交親和(self compatibility，SC)與自交不親和(self incompatibility，SI)現象并存，不同分類類群間的人工雜交親和性或可育性與雙親的系統發育及染色體倍性密切相關，總體趨勢是親緣關系越近、親和性越強，自交親和的親本種間雜交可育性大于自交不親和親本[1，6，19]；而不同亞屬間的種間雜交存在明顯的生殖障礙——不育[3]或育性較弱[12，19-21]；常綠杜鵑組種間自然雜交現象普遍，也有跨亞組間的自然雜交現象[13，19]，其組內異種雜交可育性較強且大多雙向可育[1-2].

3.1 各雜交組合的坐果率

3.2 母本和各雜交組合種子千粒重

3.3 母本和各雜交組合種子萌發率與綠苗率

3.4 各雜交組合育性綜合評價

育性是植物雜交育種成敗的關鍵.本研究中，6個雜交組合坐果率為57.14%～88.89%、種子萌發率為12.60%～65.00%、綠苗率為65.07%～90.45%，綜合評價得分最達8～10分，均為高育型類型，表明常綠杜鵑組亞組間雜交是可行的，以前人研究結果一致[1-2].

綜上所述，本研究中雖然不同雜交組合間坐果率、種子千粒重、萌發率和綠苗率存在一定差異，且親本間有正反交不對稱現象，并存在種子千粒重、綠苗率下降等問題，但所有雜交組合均達到高育型水平，說明常綠杜鵑組亞屬間雜交育種是完全可行的.今后工作中應以自然授粉結實率高、可育性強的杜鵑為母本，進一步拓展雜交種源，并借助于倍性育種、胚胎拯救、體細胞融合、基因工程等現代育種技術，改良杜鵑花性狀、培育新種質，為我國杜鵑花資源發掘與利用提供支撐.