干粉培養基的研制研究

聶娟　魯珍娥　易家玲　柳威　朱玉婷

摘 要：本文在簡要論述干粉培養基相關理論知識的基礎上，深入探討了干粉培養基研制的材料與工藝方法，并對其研制結果進行深入探討，給出了干粉培養基研制與工藝優化的實驗結論，最后將干粉培養基的研制工藝帶入實際應用，綜述了干粉培養基的實踐應用價值和前景展望，旨在為我國干粉培養基研制水平的不斷提高和應用價值的進一步凸顯提供更多參考與啟迪。

關鍵詞：干粉培養基;研制;應用價值

目前，不論是生物學界還是醫學界，所使用的培養支原體培養基絕大部分是以美國學者所發明的肉湯或瓊脂為基礎的干粉培養基，且英國、美國、日本等諸多發達國家已然將干粉培養基商業化和工業化，為工業生產做出了不可忽視的重要貢獻。我國20世紀50年代初，上海生物制藥品所就開始生產與不斷應用干粉培養基。就現階段而言，國內生產干粉培養基往往采用高溫烘干后再球磨的方式，實際生產質量較為不穩定，產量受生產工藝限制有所缺憾。在此背景下，對干粉培養基的研制研究也就具備了重要理論意義和現實價值，能有效改善我國當前干粉培養基研制效率、生產效率不高的不良狀況，不斷優化干粉培養基的研制工藝流程，從而為干粉培養基的商業化和工業化提供一定技術支撐。

1 干粉培養基概述

干粉培養基主要是指將培養基的各種成分經過一定的化學處理或物理處理，將培養基實際配方中所需的各種成分以一定量充分混合攪勻，使培養基配方呈現粉末狀態，并提取此時充分混合的粉末狀態，按照一定比例加入蒸餾水后熔化，分裝滅菌后即可投入工業生產的培養基種類。整體而言，干粉培養基生產具備工藝標準化，節約培養基單個制造時間，且實際生產質量較為穩定等諸多優勢，是適用于一般流動性及其設備簡單的小型化學實驗室使用的重要培養基類別之一，受到了諸多小型實驗室的強烈歡迎，也為小型實驗室實驗的正常推進做出了重要貢獻。我國從21世紀50年代初期著手研制干粉培養基，干粉培養基在現代醫藥單位已廣泛投入使用，無菌干粉培養基甚至列入了我國相關標準規程。

2 干粉培養基的研制與工藝優化

2.1 材料與方法

在干粉培養基的研制與工藝優化過程中，本文選擇血清干粉培養基的生產為主要研制對象，選擇Cho細胞以及上海某抗體藥物工程研究中心所提供的培養基原材料。進一步將干粉培養基以40、60、80和100℃作為四個溫度分界點，實際處理時間為10h。在使四個具備溫度點設定的干粉培養基與原方法處理的干粉培養基成為對照實驗，四個溫度點中的每個溫度點各增加兩個平行試驗，最大限度消除實驗誤差可能帶來的不良影響。在干粉培養基細胞培養過程中，主要將細胞放置于初始原始細胞密度接近于1L的搖瓶，以十天為細胞培養時間。在整個培養過程中，確保搖瓶中的pH值不低于6.8，一旦pH值低于6.8，即進行補堿工作，確定培養基中每天的糖分為3g/l，培養溫度為37℃恒溫狀態，二氧化碳體積分數為5%左右，實際培養基搖瓶轉速為125轉/min。同時，試驗人員還應在細胞培養過程中每天取樣一定量細胞進行計數，在培養液1萬轉/s的離心狀態下離心5min，使離心后的液體可用于實驗理化數據參數分析。最后，選擇干粉培養基的分析方法，可采用細胞計數、葡萄糖乳酸測定方法甚至蛋白表達量測定方法等。

2.2 結果與討論

首先，探究不同溫度條件下所處理的培養基對培養基中活細胞密度的影響，在100℃的狀態下，干粉培養基中的活細胞密度最低，深入分析造成該現象的原因可知，可能是由于干粉培養基中某些物質成分在100℃的高溫狀態處理下，會存在著部分物質成分損失以及營養成分減少等問題，嚴重影響培養基中細胞的生長與繁殖，造成活細胞密度較低這一不良現象。在培養基的磨制過程中，實際磨制工藝在瞬時溫度高達80℃以上時，對培養基中的部分熱敏感物質就會有較大破壞。

其次，探討不同溫度處理下的培養基對乳酸的最終影響，在100℃、80℃左右時，乳酸生產質量濃度最高，高達1.75克/升以上。在60℃時，乳酸濃度處于集中狀態，40℃和對照組的實驗結果顯示乳酸濃度處于最低狀態。由于乳酸濃度較高，會直接抑制干粉培養基中細胞的實際生長速度和表達方式，由此可知，當乳酸濃度較高時，細胞密度則相對較低。究其原因可知，干粉培養基的實際處理溫度較高時，會對培養基成分造成一定影響，例如，會影響培養基中關于谷氨酰胺和轉鐵蛋白等物質成分，而該類物質成分與干粉培養基中細胞的生長和正常代謝息息相關，直接會影響干粉培養基中細胞的TCL循環。當能量代謝進入了糖酵解階段或是糖磷酸支路途徑時，乳酸濃度快速升高。而乳酸濃度越低，則說明干粉培養基中的實際能量代謝所釋放的ATP數量也就越多，越有利于干粉培養基中細胞的生長和正常代謝，乳酸濃度過高，則會影響干粉培養基的細胞能量代謝過程，抑制干粉培養基中細胞的生長和最終表達。

再者，探討不同溫度處理下的培養基對目的蛋白表達量和生產量的影響，其實驗結果可知，100℃溫度條件下處理的目的蛋白表達量最低，僅僅為2.06g/l，而40℃處理后的目的蛋白表達量和實際生長量與對照組蛋白量和實際生長量最高，分別達到了2.45和2.53g/l，其他溫度條件下所處理的目的蛋白表達量均低于40℃狀態下的目的蛋白表達量，而100℃時的目的蛋白表達量含量最低。由此進一步探究目的蛋白表達量和生長量受溫度的影響可知，由于干粉培養基中的部分成分在100℃的高溫條件處理下會存在著部分物質損耗和營養成分的減少。

最后，綜合討論所有培養基實驗，對單因素結果和方差進行深度分析，比較不同培養基培養十天后的活細胞密度、乳酸含量以及其目的蛋白的表達量和生長量，并對其進行實驗結果和方差數據分析。由試驗可知，100℃的溫度條件下，活細胞的生長密度最低，而40℃的溫度條件下，活細胞的密度最高，其他溫度條件下處理的活細胞密度與對照組比較呈現出顯著性差異這一數理統計結果。當溫度條件為40℃時，pH值大于0.05，也就是數理統計上的非顯著性差異。就40℃和對照組的乳酸濃度問題而言，兩者處于最低狀態，濃度相差較小，呈現非顯著性差異，兩者數據信息較為接近。從目的蛋白的表達量和生長量來看，40℃和對照組為非顯著性差異，其他組與對照組則呈現出了顯著性差異，明顯高于其他不同條件溫度處理下的目的蛋白表達量和生長量。

2.3 結論

本文以不同溫度條件處理下的干粉培養基對Cho細胞培養以及目的蛋白表達量和生長量的影響為研究對象，確定了對干粉培養基表達和生產績效最高的實際處理溫度。進一步結合乳酸濃度、干粉培養基活細胞密度以及目的蛋白表達量數據，40℃和對照組遠遠優于其他實驗組別，其中對照組的乳酸濃度最低，實際目的蛋白表達含量最高，但對照組的培養基在其干粉處理工序上較為繁復，實際生產效率較為低下，而40℃實驗組處理后的干粉培養基活細胞生長狀況與對照組為非顯著性差異，實際處理工序卻大幅度減少，處理難度進一步降低，生產效率快速提高。綜合考慮，40℃的干粉培養基處理工序為最佳處理溫度。

3 實際應用與價值

在培養基的實際生產過程中，加強對不同溫度條件下培養基原材料的干燥處理以及不同溫度條件下培養基中最終細胞生長量、目的蛋白表達量和生產量等的探討與研究，也就能不斷優化無血清培養基的制備流程和工業生產流程，使無血清培養基能在生產成本快速降低和生產時間大量縮減的基礎上，不斷增強其最終生產質量?？傊?，無血清培養基的優化處理能為國內動物細胞培養進程提供一定支撐，也能為國內其他抗體產業的發展提供一定思考。

4 前景展望

通過本文對無血清培養基關于不同溫度條件下的相關研究，能為無血清培養基在其他影響因素上的工藝流程設計與優化提供一定參考，也能為其他類別干粉培養基工藝流程的縮減和優化提供更多支撐，更能為國內相關生物試驗的推進和國內抗體產業的不斷擴大提供一定參考。

參考文獻：

[1]翁志兵，邵晨華，胡輝.無血清培養基干粉的生產工藝優化[J].生物加工過程，2015，13（5）：57-59.