基于CT 的影像組學術前預測胃癌Ki-67表達水平的研究

董夢藝 趙秉超 李葉興 黃佳 夏婷 梁長虹 劉再毅

胃癌是全球最常見的消化系統惡性腫瘤之一，我國胃癌發病率在各種惡性腫瘤中位居第2 位，每年新增病例約67.9 萬例，導致死亡約49.8 萬例[1]。Ki-67 是一種識別增殖期細胞核內相關抗原的單克隆抗體，其表達陽性率的高低與胃癌的分化程度、淋巴結轉移及預后密切相關[2-4]。因此，Ki-67 可能成為可靠、快速測定胃癌增殖率的重要工具，而胃癌增殖細胞百分比的準確測定對預后有重要價值，對選擇合適的治療方法也有重要意義。目前臨床上常用病理免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）方法檢測胃癌Ki-67 表達水平，但其有創、耗時且成本高。影像組學可從醫學影像中提取海量的定量特征進行分析以協助臨床決策，研究表明影像組學可用于術前預測乳腺癌、腎上腺癌等腫瘤的Ki-67表達水平，但在胃癌方面尚未見相關報道[5-7]。因此，本研究擬建立并驗證基于術前增強CT 的影像組學諾謨圖以預測胃癌Ki-67 表達水平。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧性收集2009 年1 月—2019年1 月行上腹部CT 增強掃描且術后行胃癌組織Ki-67 表達水平檢測的胃癌病人468 例，其中男297 例，女171 例，年齡26～88 歲，平均（59.03±12.24）歲。將病人隨機分為訓練集[310 例，男196例，女114 例，年齡27～88 歲，平均（59.39±12.72）歲]和驗證集[158 例，男101 例，女57 例，年齡26～83歲，平均（66.83±6.10）歲]。納入標準：①手術切除且經術后病理確診為胃腺癌；②經術后IHC 檢測Ki-67表達水平；③術前行增強CT 檢查且可明確顯示癌灶。排除標準：①術前行放療、化療或放化療；②CT影像不符合后處理要求，如影像質量差、癌灶過小或胃充盈差而無法清晰顯示病灶等。本研究經倫理委員會批準，豁免簽署病人知情同意書。

1.2 設備與方法 采用西門子Somatom Definition Flash CT、飛利浦256 層Brilliance iCT 設備，掃描范圍自膈頂至雙腎下級。掃描參數：管電壓120 kV，管電流130 mA，層厚、層間距及重建厚度均為1 mm，旋轉時間0.5 s/r，FOV 36 cm×36 cm，矩陣512×512。對比劑使用碘普羅胺（含碘370 mg/mL），經前臂靜脈注入對比劑（1.5 mL/kg 體質量），注射流率為3.5 mL/s，分別于注射對比劑后30、60、180 s 獲取動脈期、門靜脈期及延遲期CT 影像。

1.3 病理檢查及Ki-67 表達水平評定 記錄病人腫瘤部位（胃上部、胃中部、胃下部），以及術前活檢病理分化程度（高分化、中分化、低分化）、Lauren 分型（腸型、彌漫型、混合型）、血清癌胚抗原（CEA）（正常、升高）和糖類抗原CA19-9 水平（正常、升高）。術后1 周內通過IHC 檢測Ki-67 水平，記錄顯微鏡（×40）下每1 000 個細胞中Ki-67 標記陽性細胞百分比，根據Ki-67 表達水平（≥50%為高表達，<50%為低表達[8]）將病人分為高表達組（訓練集177 例，驗證集79 例）和低表達組（訓練集133 例，驗證集79 例）。

1.4 影像組學分析

1.4.1 興趣體積（volume of interest，VOI）勾畫 從圖像存儲與傳輸系統（PACS）工作站以DICOM 格式導出門靜脈期CT 影像，由2 名有經驗的放射科醫生使用ITK-SNAP 圖像處理軟件（版本3.6.0，www.itksnap.org）手動勾畫腫瘤VOI。自病灶起始層開始連續勾畫興趣區（ROI），沿腫瘤輪廓分割，避開胃腔內氣體、壞死區、腫大淋巴結及外周的脂肪等（圖1）。連續勾畫層面包括整個病灶，最后將病人多層ROI 整合為VOI。

1.4.2 影像組學特征的提取 提取的影像組學特征包括手工特征和深度學習特征。手工特征提?。航厝OI 每一層面的最小外接矩形，將矩形中不屬于腫瘤區域的像素置零，然后使用MATLAB 2016（MathWorks，Natick，MA）提取手工特征，包括一階統計量、紋理特征、形態學特征、濾波特征。深度學習特征提?。菏褂糜嬎銠C視覺領域廣泛應用的遷移學習技術提取，截取腫瘤圖像最大層面的最小外接矩形，并標準化為224×224 像素，輸入MATLAB 上預訓練好的VGG16 模型（ww2.mathworks.cn），將模型的最后隱含層移除，最后輸出的特征作為本研究使用的深度特征。

1.5 特征的篩選和影像組學諾謨圖的構建 篩選與胃癌Ki-67 表達水平高度相關的影像組學特征。首先通過計算組內和組間相關系數（ICC）評估特征的穩定性，對穩定的（ICC≥0.9）的手工特征和深度學習特征分別篩選。手工特征篩選采用最大相關最小冗余（mRMR）及遞歸特征消除（RFE）方法；深度學習特征篩選采用單因素分析[計算單一特征的受試者操作特征（ROC）曲線下面積（AUC），按AUC 大小進行降序排列，選取AUC 較大的特征進行分析]及隨機森林（RF）方法。將篩選后與胃癌Ki-67 表達水平高度相關的手工特征和深度學習特征聯合建模[9]。采用支持向量機（support vector machine，SVM）構建影像組學標簽（https://github.com/Bingchao-Zhao/CT-prediction-ki67.git），并計算每例病人的影像組學評分（Rad-score）。

1.6 統計學方法 采用R 軟件（version3.6.1）和SPSS 20.0 軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，2 組間比較采用獨立樣本t 檢驗。計數資料以例（%）表示，2 組間比較采用卡方檢驗。采用多因素邏輯回歸分析潛在的臨床危險因素，將這些危險因素聯合影像組學標簽建立影像-臨床聯合預測模型，并生成影像組學諾謨圖。采用ROC 曲線評估影像組學標簽和諾謨圖的性能，計算AUC 并比較。采用校準曲線評估聯合預測模型在術前預測Ki-67 狀態的結果與術后病理真實狀態的擬合度，并采用決策曲線分析（decision curve analysis,DCA）對驗證集影像組學諾謨圖預測的臨床有效性進行分析，計算凈獲益時的閾值概率。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

圖1 胃癌病灶ROI 手動勾畫示意圖。A 圖為腹部增強CT 門靜脈期影像，可見胃壁局灶性增厚且明顯強化。B 圖為手動分割的ROI，紅色區域為癌灶ROI。

2.1 Ki-67 高表達與低表達病人的臨床及病理特征比較 訓練集中，2 組間性別、CEA 水平、術前病理分化程度、Lauren 分型間差異均有統計學意義（均P<0.05），詳見表1。驗證集中，2 組間年齡、性別、Lauren 分型差異均有統計學意義（均P<0.05），詳見表2。訓練集和驗證集中，2 組間CA19-9 水平、腫瘤部位差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

2.2 Ki-67 高表達與低表達病人Rad-score 的比較 訓練集和驗證集中，Ki-67 高表達者的中位Rad-score（分別為1.022、1.154）均高于低表達者（分別為0.648、0.626），差異均有統計學意義（分別t=50.187，P<0.001；t=31.333，P<0.000 1）。

2.3 影像組學特征篩選及分析結果 基于訓練集數據最終篩選出與Ki-67 表達水平高度相關的9個手工特征和11 個深度學習特征，輸入SVM 構建影像組學標簽（圖2）。

2.4 影像組學標簽和諾謨圖對Ki-67 表達的預測效能分析

2.4.1 影像組學標簽預測效能 訓練集和驗證集的影像組學標簽預測的AUC 分別為0.637（95%CI：0.570～0.704）、0.724（95%CI：0.641～0.807）（圖3）。

2.4.2 臨床危險因素分析 多因素邏輯回歸分析結果顯示年齡和Rad-score 是與Ki-67 高表達相關的臨床獨立危險因素（表3）。年齡的優勢比（OR）值為4.154，在其他因素保持不變的情況下，年齡每增加一歲，Ki-67 高表達的風險就增加了4.154 倍；Rad-score 的OR 值為1.320，在其他因素保持不變的情況下，Rad-score 的分數越高，Ki-67 就越趨向于高表達。

表1 訓練集中Ki-67 低表達和高表達病人的基本臨床和病理特征比較 例（%）

表2 驗證集中Ki-67 低表達和高表達病人的基本臨床和病理特征比較 例（%）

圖2 手工特征及深度學習特征的篩選流程圖

圖3 基于增強CT 影像組學標簽預測Ki-67 表達水平的ROC 曲線

表3 胃癌Ki-67 高表達狀態的獨立危險因素分析

2.4.3 諾謨圖預測效能 最后選取臨床獨立危險因素中的年齡與影像組學標簽構建聯合預測模型，并生成諾謨圖（圖4）。訓練集和驗證集采用聯合預測模型的AUC 分別為0.656（95%CI：0.589～0.724）、0.733（95%CI：0.650～0.816）（圖5）。與影像組學標簽預測的AUC 相比，該聯合模型對于Ki-67 表達水平的術前預測表現出更好的效能。諾謨圖校準曲線顯示訓練集和驗證集對Ki-67 表達水平的預測結果與術后病理免疫組化結果之間的一致性均較好，且在驗證集中的結果優于訓練集（圖6）。諾謨圖在驗證集中進行DCA，在閾值概率為11%～62%時，影像-臨床聯合預測模型具有更大的凈獲益（圖7）。

3 討論

1983 年，Gerdes 等[10]發現Ki-67 抗原是一種在增殖細胞中表達的核抗原，這種抗原可反映細胞周期中活性細胞的比例，是評估多種腫瘤細胞增殖的有效參數。有多項研究[11-14]表明Ki-67 表達水平與胃癌生長動力學的異質性、分級、分期和預后密切相關。

圖4 訓練集諾謨圖。由影像組學標簽與年齡聯合構建的影像組學諾謨圖。

圖5 諾謨圖預測Ki-67 表達狀態的ROC 曲線

圖6 諾謨圖校準曲線。諾謨圖對Ki-67 表達水平預測的結果與病理結果間一致性均較好，且在驗證集中的結果優于訓練集。

圖7 驗證集中諾謨圖DCA。在閾值概率為11%～62%時，應用影像組學諾謨圖具有良好的凈獲益。

目前臨床常規Ki-67 檢測多采用IHC 方法，這種傳統檢測方法耗時且成本高。Ki-67 表達在胃癌中存在異質性，在腫瘤內不同區域增殖率不等，僅依靠核心活檢標本無法全面評估病灶的Ki-67 表達，有必要基于腫瘤整體對其進行全面評估[15]。影像組學方法具有解析腫瘤異質性的潛能，能夠充分挖掘醫學圖像中所包含的數字信息，且可以預測某些腫瘤的分子分型等臨床病理信息[16]。傳統的影像組學特征通常為一般的手工特征，而基于深度學習的特征主要通過卷積神經網絡來提取，特征學習來源于數據本身，可以提取種類豐富的深度特征，在圖像信息采集方面能夠做到更加全面[17-18]。而將聯合模型以諾謨圖的形式呈現，可以更方便臨床醫師通過簡單的評分來獲得有效的個體化預測信息，以協助臨床決策，改善胃癌病人預后。

本研究構建了一種預測胃癌病人術前Ki-67表達水平的無創聯合模型。通過結合深度學習特征和手工特征來構建影像組學標簽，在訓練集病例中行多因素邏輯回歸分析得到與Ki-67 高表達顯著相關的臨床危險因素（年齡），將其與影像組學標簽聯合構建了影像-臨床聯合模型，進而獲得諾謨圖并分析其預測效能。研究顯示聯合模型評估Ki-67表達水平在訓練集和驗證集中均表現良好，且諾謨圖的預測效能均優于單純采用影像組學標簽預測的效能，這表明加入了臨床危險因素的聯合模型有潛力改善治療策略。分析原因可能是Ki-67 表達水平越高則腫瘤細胞增殖越活躍，血管內皮生長因子受到刺激后使得小血管增生，從而導致腫瘤強化明顯及浸潤深度增加；而且Ki-67 的表達與許多基因的表達都有明顯的正相關性，這些因素都使得基于影像來提取的手工特征和深度組學特征能夠更好地反映腫瘤的病理學特征。有研究[19]利用邏輯回歸分析也發現胃癌的Ki-67 的表達與年齡、淋巴結轉移和TNM 分期顯著相關，與本研究篩選到的臨床危險因素結果基本相符。通過對臨床危險因素分析及諾謨圖的解讀發現，病人的年齡越大、Rad-score評分越高，胃癌組織Ki-67 就越趨向于高表達。本研究訓練集和驗證集中Ki-67 高表達者的中位Rad-score 均高于低表達者，Rad-score 是基于影像組學標簽得出的，這表明我們篩選兩類特征最后構建的影像組學標簽有利于鑒別高低表達組。

校準曲線顯示諾謨圖對Ki-67 表達水平預測的結果與病理結果間一致性均較好，且在驗證集中的結果優于訓練集，在驗證集中進行DCA，在閾值概率為11%～62%時，影像-臨床聯合預測模型能獲取更大的凈獲益，表明基于影像并結合臨床危險因素建立的模型具有良好的穩定性及泛化能力，有望應用于臨床。Paul 等[9]的研究從CT 影像中提取了深度學習特征和手工特征對肺癌病人淋巴結轉移評估，顯示該方法具有潛在的預測能力，采用最近鄰分類器的AUC 為0.713；但由于數據僅有40 例，他們使用一種內部驗證方法即5 倍交叉驗證來評估模型的性能。本研究的模型是納入了158 例病人的獨立驗證集，結果更具有可信度；且加入了臨床危險因素，使得本研究模型的效能要高于Paul 等[9]的結果。同時，本研究也證明了基于影像的多標簽分析可能是一種改善臨床治療更有效的方法。

在腫瘤Ki-67 無創預測方面，許多影像組學的研究在乳腺癌、肺癌、肝癌等方向均有涉及，Liang等[20]基于MRI-T2WI 建立的影像組學標簽分類器在評估預測Ki-67 狀態時表現出良好的效能，對比本研究，可能是由于胃癌不像乳腺癌那樣在領域內有一個相對恒定、公認的閾值(14%)，且有部分研究甚至劃分了多個閾值來分別評估分類效能。本研究結合數據本身特征及以往類似研究選取了50%作為分類閾值，得到了相對較好的結果，未來研究中我們將繼續探索胃癌Ki-67 表達水平的最佳閾值。

另外，影像組學對胃癌的臨床診斷、分期及預后評估方面也起著不可忽視的重要作用。Ma 等[21]通過勾畫胃淋巴瘤和胃癌VOI 并篩選最有價值的紋理特征，同時選用CT 報告的客觀特征（胃壁厚度等）及臨床特征，分別建立人工判斷模型、紋理特征模型及兩者聯合的模型，用于鑒別胃淋巴瘤與彌漫浸潤型胃癌，結果表明聯合模型的診斷效能最高。本研究提取了深度學習特征及手工特征，深度和維度都遠高于單一的紋理特征，能納入模型的鑒別信息更豐富，但我們最后的聯合模型效能卻略遜于他們的模型效能，分析原因或許是他們研究中的人工判斷模型對聯合模型的附加價值要高于我們挑選的臨床危險因素對聯合模型的附加價值，在人工判斷模型中，診斷醫師可以根據不同掃描期相胃壁形態改變、病灶的強化模式來靈活評估胃壁的蠕動性，而本研究只有門靜脈期的影像信息；且醫師對胃周脂肪浸潤情況和腫大淋巴結的評估是我們研究中VOI 并沒有納入的重要診斷信息。我們將在以后的研究中進一步探索這些重要的影像特征對聯合模型的附加價值。

本研究還存在一些不足。首先，本研究為回顧性研究，存在不可避免的選擇性偏倚，且病人來自同一機構的單中心研究，研究結果有待多中心、多樣本進一步研究驗證。其次，本研究僅從門靜脈期CT 影像中提取影像組學特征。雖然在門靜脈期可以更清楚地顯示腫瘤結構，但未來研究中若能融合平掃、動脈期、延遲期等多時相影像可望提高影像組學模型預測Ki-67 表達水平的性能。再者，VOI 的手工勾畫耗時耗力，且沒有標準化的勾畫流程與規則，可能導致不同勾畫者間一致性不佳，全自動識別腫瘤病灶進行特征提取是未來的研究方向之一。

綜上所述，影像組學可提供更為客觀的、與組織病理學以及IHC 標志物相關的圖像特征信息；而深度學習特征又在一定程度上提高了傳統手工特征的預測效能，聯合基于CT 增強影像的影像組學標簽及臨床病理信息建立的影像組學諾謨圖可用于術前預測胃癌病人Ki-67 狀態。本研究所采用的影像組學研究方法，只需要依賴臨床可方便獲取的常規CT 增強影像進行分析，可減輕病人額外的檢測負擔，具有方便、無創、可重復的特點，因此在臨床應用方面體現出重要的價值，有望作為重要的臨床決策輔助工具。未來如何更好地挖掘信息來輔助臨床決策，從而使病人得到更精準的個體化治療，這也是影像組學發展中的機遇與挑戰。