PGPR 菌劑對辣椒的促生效應及根際土壤細菌的響應研究

黃文茂，詹永發，王 歡，韓麗珍*

（1．貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025；2．貴州省農業科學院辣椒研究所，貴州 貴陽 550006）

根際土壤微生物（Rhizosphere Soil Microorganism）在根際土壤中扮演著至關重要的角色，與植物共同構成了復雜的土壤生態系統。微生物在土壤中的生命代謝活動是土壤礦物養分循環和能量轉換的驅動力，對維持土壤肥力作出了巨大的貢獻［1］。因此，評價土壤肥力或土壤質量優劣時，不僅以土壤微生物及功能菌群的數量作為指標，還常常以土壤中的微生物種群多樣性作為重要的評價指標［2］。根際土壤微生物的種群多樣性受多種因素影響，除了土壤理化因子［3］和植物釋放到土壤中的一些根系分泌物外［4］，人工施肥對土壤微生物群落結構也有顯著影響，且微生物群體隨著施肥類型和施肥量的不同而有所變化［5-7］，而外施微生物菌劑也會影響土壤的微生物多樣性。

辣椒（Chilli），茄科辣椒屬植物，因其果實具調味功能且營養豐富而備受青睞，是全球種植面積最廣的蔬菜作物之一。近年來市場需求量的激增和土壤日益惡化，使研究者將重心放在辣椒高產品種選育和肥料控釋技術兩個方向上，但新品種的選育過程繁瑣而費時，肥料控釋技術又無法從根源上改善土質。因此，微生物菌劑作為一種新型肥料，由于其在促進作物增產的同時，還能有效改善土壤狀況，防止土壤退化而引起人們的重視［8］。

植物根際促生菌（Plant Growth Promoting Rhizobacteria，簡稱PGPR）是一類環境友好且對植物生長有利的微生物類群，現已被開發成各種劑型菌劑施加到作物上，并取得了預期效果。PGPR 主要分布于植物根際周圍，是根際土壤微生物群落結構的重要組成部分。根據其在植物根際的定植位置可分為胞內PGPR（Intracellular PGPR，iPGPR）和胞外PGPR（Extracellular PGPR，ePGPR）兩類［9］，iPGPR 通常存在于植株根部某些特定的組織或細胞內，通過分泌生長素（Indole-3-acetic Acid，IAA）、赤霉素（Gibberellin，GA）、細胞分裂素（Cytokinin，CTK）等生長激素促進植株生長［10-11］；ePGPR 則主要定植于根表皮及根圍土壤中，絕大多數PGPR都屬于這類定植方式，ePGPR 在土壤中的代謝活動一方面加快了土壤養分循環，促進植物對礦物營養的吸收，另一方面某些PGPR 還可以分泌具有抑菌作用的次生代謝物，誘導系統抗性，增強植物的抗病害能力［12］。在研究芽孢桿菌屬兩個菌株B. licheniformisCECT 5106 和B. pumilusCECT 5105對意大利石松（Pinus pineaL.）幼苗的促生作用時，Probanza 提出“PGPR 改變根際土壤微生物群落結構是其另一種促生機制”的假說［13］，遺憾的是，至今鮮有相關研究證明。盡管也有文獻報道外施微生物制劑可以改變植物根際土壤微生物群落結構［14-16］，但在田間種植辣椒的根際土壤微生物對外施微生物菌劑如何響應尚未可知。本研究以4 株具優良促生能力的PGPR 菌株制成液體復合菌劑在田間條件下進行辣椒接種，通過功能菌群數量的改變分析外施PGPR 菌劑對根際土壤微生物的影響，并進一步利用高通量測序技術深入探究辣椒根際細菌群落對復合菌劑灌根的響應，以及細菌群落結構的變化與辣椒促生之間的相關性，為解析PGPR 菌劑對辣椒的田間促生機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及試驗材料

供試菌株是由本實驗室前期分離純化得到的4株具有優良促生性能的菌株:HGD3（Pseudomonas putida）、HGD12（Bacillus flexus）、HP9（Bacillus velezensis）、HP10（Bacillus firmus）。試驗所用辣椒品種名為遵辣9 號，由貴州省遵義市農業科學院選育提供。

1.2 試驗大田概況

試驗大田位于貴州省遵義市播州區楓香鎮楓元村堰塘組（E106°34′23″，N27°35′29″），所處緯度較低，常年日照充足，雨量充沛。大田土壤類型為黃壤，前茬作物為豇豆和蠶豆。試驗處理前土壤理化指標如下:有機質含量36.57 g/kg，全氮2.16 g/kg，全磷1.28 g/kg，全鉀13.53 g/kg，堿解氮164 mg/kg，有效磷74 mg/kg，速效鉀150 mg/kg。

1.3 PGPR 復合菌劑的制備

分別按1%接種量將各菌株甘油保種液接種至LB 培養基（Luria-bertani）中，180 r/min，30℃恒溫搖床過夜培養活化，再以5%接種量將活化菌液轉接至新鮮LB 培養基中擴培24 h，離心去上清并以新鮮LB 培養基重懸菌體，調節有效活菌數濃度為1010cfu/mL，等量混合備用，施用前以自來水稀釋25 倍后澆灌。

1.4 試驗設計及樣品采集

以全量化肥為對照（CK），試驗共設計了2 個處理:PGPR 菌劑+全量化肥（PGPR-CF1）；PGPR菌劑+80%化肥（PGPR-CF2）。其中全量化肥標準為:化肥（總養分≥45.0%，N-P2O5-K2O:15-15-15） 750 kg/hm2，磷酸二銨（總養分≥64.0%，N-P2O5-K2O:18-46-0） 300 kg/hm2，各處理分別設置3 個重復。育苗按常規措施進行，幼苗移栽時間為2018 年4 月20 日，選取長勢一致的辣椒幼苗，采用錯位種植法進行種植，每處理種植兩壟，每壟種植兩行，壟間距0.6 m，株間距0.5 m。起壟時施加化肥，PGPR 菌液于幼苗移栽后7、30、60 d 對辣椒進行灌根（每株100 mL）。

在盛果期采集土壤，根際土壤采集參照Courchesne F 等方法［17］，每個重復隨機采集3 株辣椒的根際土壤50 g 混勻作為一份土樣，裝入無菌自封袋密封，作好標記并立即放入冰盒帶回實驗室。土樣細菌多樣性分析由深圳華大基因科技服務有限公司進行。

1.5 辣椒產量指標測定

辣椒采收期為2018 年7 月28 日至11 月1 日，共采收5 次。統計每輪采摘期各重復所摘辣椒重量，采收結束后計算辣椒的單株掛果數、單株產量，并對辣椒單果重量進行統計。

1.6 根際土壤細菌和功能菌群數量的測定

辣椒根際土壤細菌總數和功能菌群（溶磷菌、固氮菌、解鉀菌）數量通過稀釋平板涂布法完成。細菌計數培養基為LB 瓊脂培養基，溶磷菌計數培養基為Pikovaskaia's（PKO）無機磷瓊脂培養基，固氮菌計數培養基為阿須貝氏瓊脂培養基，解鉀菌計數培養基為硅酸鹽細菌培養基。

1.7 根際土壤細菌DNA 提取及高通量測序數據處理

根際土壤細菌總DNA 采用試劑盒（Power Soil?DNA Isolate Kit，美國Mobio）進行提取并純化。DNA提取純化完成后，以帶Barcode 序列的特異引物進行細菌16S rRNA 基因V3-V4 區的PCR 擴增，引物序列分別如下:515F:5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’；806R:5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’，并采用Illumina-MiSeq 平臺進行Paired-end 測序。

1.8 統計分析

通過Mothur（version:v.1.30.1）計算Alpha 多樣性指數，并結合R 語言等相關軟件繪制PCA 主成分分析圖、物種profiling 面積圖和柱狀圖、組間Alpha 多樣性盒形圖等。不同處理間的差異顯著性檢驗通過SPSS 20.0 進行One way-ANOVA 及Duncan 檢驗，辣椒產量、掛果數與土壤細菌Alpha多樣性指數之間的相關性通過Pearson（2-tailed）分析得到，并采用Office 2019 進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 施加PGPR 菌劑對辣椒產量指標的影響

對辣椒單果重量分析表明，施加PGPR 菌劑對果實增重具有顯著促進作用，其中，施加PGPR 菌劑的全量化肥組（PGPR-CF1）單果重較對照增加11.88%，80%化肥組的PGPR 處理（PGPR-CF2）增加14.36%。同時，施加PGPR 菌劑均可以促進辣椒單株掛果數增多和單株產量的增加，PGPRCF1 與PGPR-CF2 的單株產量較對照分別提高28.74%和22.10%（表1）。

表1 不同施肥處理的辣椒產量變化

2.2 施加PGPR 菌劑對根際土壤細菌及功能菌群數量的影響

辣椒根際土壤中細菌數量和功能菌群數量的分析結果（表2）表明，施加PGPR 菌劑顯著影響辣椒根際土壤細菌數量和功能菌群數量（P＜0.05）。與CK 相 比，PGPR-CF1 和PGPR-CF2 處 理 組 的細菌總量分別提高了3.02 和2.82 倍。經PGPR菌劑處理后，根際土壤功能菌群數量顯著提高（P＜0.05），處理組的溶磷菌和固氮菌數量均顯著高于CK，其中溶磷菌提高約4 倍，固氮菌提高約9 ～10 倍；而PGPR-CF1 和PGPR-CF2處理根際土壤解鉀菌的數量比CK 分別增加了168%和195%。

表2 不同施肥處理的辣椒根際土壤功能菌群數量

2.3 施加PGPR 菌劑對辣椒根際土壤細菌Alpha 多樣性的影響

9 個根際土壤樣本經Illumina MiSeq 平臺測序后一共得到有效序列573 896 條，平均每個樣本63 766 條，在97%相似度下將得到的序列聚類共得到3 164 個OTUs，各土樣OTUs 數量分別為2 153 個（CK）、2 337 個（PGPR-CF1）、2 358 個（PGPR-CF2） （表3），所有土壤樣本的測序覆蓋率均達到了0.98 以上（圖1a），說明土樣中細菌已基本完全被測出，該測序深度能夠比較真實地反映土壤細菌的群落組成結構。

Alpha 多樣性指數（Chao1 指數、Ace 指數、Shannon 指數、Simpson 指數等）能夠表征物種的多樣性及物種豐度。對PGPR 菌劑灌根后辣椒根際土壤細菌的Alpha 多樣性分析結果見表3。配對t檢驗（圖1b），PGPR 菌劑灌根能夠增加辣椒根際土壤的細菌物種數量，但差異不顯著（P＞0.05），相 比 于CK，PGPR-CF1 和PGPR-CF2 根 際 土 壤中可觀察到的物種數分別增加了184 和205 個。Chao1 指數和Ace 指數表明，PGPR 菌劑灌根的辣椒根際土壤細菌豐富度均高于單施全量化肥，以PGPR-CF2 處理組的細菌豐富度最高；PGPR 菌劑處理組Shannon 指數均高于對照，表明PGPR 菌劑能夠增加辣椒根際土壤細菌的群落多樣性；但CK和PGPR-CF1 組的Simpson 指數基本相同，PGPRCF2 處理組的Simpson 指數最低，表明化肥減量且PGPR 菌劑的處理組中，根際土壤細菌優勢度更高，化肥施加量可能對根際土壤優勢種群有一定的影響。

圖1 不同施肥處理辣椒根際土壤所觀察到測序深度及物種數的盒形圖

表3 不同施肥處理的辣椒根際土壤細菌Alpha 多樣性指數

圖2 不同施肥處理辣椒根際土壤細菌在門水平上的相對豐度

2.4 辣椒根際土壤細菌群落組成結構差異

對比數據庫Greengene_2013_5_99，對所有土樣測得3 164 個OTUs 對應的物種信息進行分類統計，歸屬到37 個門；其中CK 和PGPR-CF1 分別檢 測 到34 門，PGPR-CF2 檢 測 到36 門（ 圖2）。Candidate division OP3 是PGPR 菌劑灌根處理土壤獨有的門，Thermi 和NKB19 是PGPR-CF2 獨有的門，GN02 是CK 和PGPR-CF1 共有的門。

在3 個實驗組中，相對豐度大于1%的有13個門，分別為酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、泉古菌門（Crenarchaeota）、藍藻門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、浮霉菌門（Planctomycetes）、變形菌門（Proteobacteria）、TM7 和疣微菌門（Verrucomicrobia）。其中，酸桿菌門、放線菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、浮霉菌門和變形菌門為辣椒根際土壤中的優勢門，在辣椒根際土壤中累計分別占細菌總數的83.7%（PGPR-CF1）、79.55%（PGPR-CF2）和79.77%（CK）。

但是，不同處理組部分細菌類群的相對豐度發生改變，PGPR-CF1 和PGPR-CF2 辣椒根際土壤中擬桿菌門的相對豐度較對照分別增加了10.11%和39.28%，厚壁菌門的相對豐度分別增加了12.64%和37.33%；PGPR 菌劑灌根土壤芽單胞菌門、藍藻門和柔膜菌門（Tenericutes）呈現下降趨勢，以芽單胞菌門下降最明顯，PGPR-CF1 下降了21.44%，PGPR-CF2 下降了13.29%。顯然，PGPR 菌劑的處理改變了土壤中原有細菌群落的結構。

在目水平上對辣椒根際土壤細菌群落組成結構進一步分析，所有土樣共檢測到42 個目（圖3）。菌劑處理組細菌相對豐度最高的是鞘氨醇桿菌目（PGPR-CF1，9.27%；PGPR-CF2，7.42%），而全量化肥（對照）組根際土壤中為酸桿菌目（CK，9.05%）；另外，相對豐度大于5%的細菌目在CK 中還包括Solibacterales（6.12%）和鞘氨醇桿菌目（7.96%），而在PGPR-CF1 和PGPR-CF2 處理組中，相對豐度大于5%的細菌類群還包括酸桿菌目（7.93%，6.71%）、Solibacterales（6.89%，5.28%）、腐生螺旋體菌目（5.48%，6.76%），WD2101（PGPRCF1，5.13%）和iii1-15（PGPR-CF2，6.21%）的相對豐度也大于5%，PGPR 菌劑處理的辣椒根際土壤中表現出更為豐富的細菌群落結構。此外，在PGPR菌劑灌根的辣椒根際土壤中，部分類群的相對豐度發生改變，具體而言，芽孢桿菌目（Bacillales）、伯克霍爾德氏菌目（Burkholderiales）、紅螺菌目（Rhodospirillales）、腐生螺旋體菌目（Saprospirales）、鞘氨醇桿菌目（Sphingobacteriales）、黃單胞菌目（Xanthomonadales）所占比例均有所增大，而酸桿菌目（Acidobacteriales）、黃桿菌目（Flavobacteriales）、Ellin5290、Ellin6067、芽單胞菌目（Gemmatimonadales）、MND1、Thermogemmatisporales 相對豐度則有所下降（表4）。

圖3 不同施肥處理辣椒根際土壤細菌在目水平上的相對豐度

表4 不同施肥處理辣椒根際土壤細菌在目水平上的變化 （%）

2.5 辣椒根際土壤細菌主成分分析

基于OTUs 豐度進行主坐標分析（PCA），評估PGPR 菌劑灌根對辣椒根際土壤細菌群落結構的影響。PC1 和PC2 是解釋不同處理土壤樣本間差異性的主要成分，解釋度分別為38.07%和20.72%（圖4）。不同施肥處理辣椒根際土壤細菌的群落結構差異明顯，圖中PGPR-CF1 與PGPR-CF2 的距離在PC1 上相距較遠，在PC2 上距離較近；而CK與PGPR-CF1 在PC1 上的距離更近，表明菌劑和化肥的施用共同影響了辣椒根際土壤細菌群落結構，且化肥用量的提高可對根際土壤細菌群落結構造成更大的影響。

圖4 不同施肥處理辣椒根際細菌的PCA 分析

2.6 根際土壤細菌多樣性和產量指標之間的關系

對PGPR 菌劑灌根辣椒根際土壤細菌多樣性與產量指標之間的相關性分析（表5）表明，根際土壤細菌Alpha 多樣性的Chao1、Ace、Shannon 指數與單果重量、單株掛果數、單株產量呈正相關關系，但不顯著（P＞0.05）；Simpson 指數與單果重量呈負相關，相關性不顯著（P＞0.05），但與單株掛果數、單株產量之間沒有相關性。

表5 辣椒產量指標與根際土壤細菌Alpha 多樣性指數之間的相關性

3 討論

以植物生長促進菌制成的微生物菌劑是目前研究較多的生物肥料之一，其富含功能微生物，在農林業生產上發揮著修復土壤，維持土壤肥力和促進增產等作用［18］。近年來國內外研究人員大多關注PGPR 菌株在實驗室條件下促生效果及機制的研究［11，19-20］，而大田條件下促生菌對辣椒促生增產及根際土壤微生物群落結構影響的報道很少。本文利用PGPR 菌劑和化肥配施，在田間條件下對辣椒的產量、辣椒根際土壤細菌數量、功能菌群數及細菌群落結構進行了系統地研究。結果表明，施加PGPR 菌劑的2 個處理組中，辣椒單果重、單株掛果數及單株產量均較全量化肥（CK）有不同程度的提高，表明PGPR 菌劑的施加提高了辣椒產量。細菌數及功能菌群數測定的結果顯示，施加PGPR菌劑明顯提高了辣椒盛果期根際土壤中細菌、溶磷菌、固氮菌和解鉀菌的數量。從細菌數量上來看，100%化肥配施PGPR 菌劑相對高于80%化肥配施PGPR 菌劑，這可能是全量化肥條件下引起土壤化學成分的改變，為微生物的代謝提供了營養來源，刺激土壤中微生物活性的提高，從而引起細菌代謝加快，數量提高［21-22］。

本文采用灌根的方法，研究了PGPR 菌劑對辣椒根際土壤細菌多樣性及群落結構的影響。高通量測序結果顯示，PGPR 菌劑灌根改善了辣椒根際土壤細菌的物種豐度和多樣性，其中PGPR-CF2 處理根際土壤細菌多樣性最高，PGPR-CF1 處理次之，CK 處理最差，這與雷先德等［5］的研究結論一致。表明PGPR 菌劑能夠在一定程度上維持和提高根際土壤細菌豐度和多樣性；Simpson 指數表明，全量化肥配施PGPR 菌劑及單施全量化肥條件下，根際土壤細菌的物種優勢度相對高于配施80%化肥的菌劑組，前人研究表明［23-24］，施肥對土壤微生物群體變化影響較大，不同施肥量引起的C/N 變化影響了土壤微生物活性，氮肥雖然不支持細菌生長，但當氮肥與易分解底物結合時，有利于土壤中某些優勢細菌種群的生長，加快了這類細菌的新陳代謝，從而促進其大量繁殖。

對根際土壤細菌群落結構的分析發現，不同施肥處理的辣椒根際土壤細菌群落結構具有一定的相似性，表現為主要的優勢菌門為酸桿菌門、放線菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門、變形菌門和疣微菌門等7 個類群；但相較于對照，經微生物菌劑處理后細菌的群落結構又有所差異，賀國強等［25］利用解磷固氮復合菌劑研究其對小麥根際土壤細菌群落的影響時發現，解磷固氮復合菌劑降低了芽單胞菌門的相對豐度，這與本研究結論一致，但與藍藻門相對豐度減少的結論有所差別，也有研究表明藍藻的豐度因土壤類型、養分和采樣期溫度等不同而呈現一定差異［26-27］。此外，PGPR 菌劑處理的兩種土壤樣本中均檢測到了Candidate division OP3，CK 處理中并未發現，但在PGPR-CF1 和CK處理中檢測到了GN02，PGPR-CF2 中單獨檢測到Thermi 和NKB19，結合主成分分析（PCA）可知，辣椒根際土壤細菌群落結構的變化與PGPR 菌劑和化肥量有關。

不同施肥處理辣椒根際土壤細菌群落結構在目水平差異也較大。2 個PGPR 菌劑灌根處理組相對豐度最高的是鞘氨醇桿菌目，而全量化肥組相對豐度最高的酸桿菌目。在以往的文獻［28-31］中多次報道了鞘氨醇桿菌目的某些種屬（Sphingobacteriumsp.，Sphingobacterium pakistanensissp. nov.，Sphingobacterium canadense）可 以 產 生IAA、ACC 脫 氨酶、鐵載體等，具有顯著的促生特性，而根際土壤中具有促生功能的相關菌群豐度提高，也可能是辣椒產量增高的原因之一。本研究發現，PGPR 菌劑灌根處理中酸桿菌目的相對豐度均低于常規處理。Kalam 等［28］研究表明，接種PGPR 后，番茄和黑豆根際土壤酸桿菌數量在60 d 內總體增加；但最近一項研究顯示，滴施含枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）的可濕性粉劑、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）菌劑以及含枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、膠質芽孢桿菌（B. licheniformis）、巨大芽孢桿菌（B. megaterium）的復合菌等不同生物菌劑后，棉花根際土壤酸桿菌的豐度均表現降低［32］；顯然，不同微生物菌劑對根際土壤酸桿菌的種群密度影響尚有爭論。此外，PGPR 菌劑灌根還增加了辣椒根際土壤中芽孢桿菌目（Bacillales）的相對豐度，本研究所采用菌劑包含的菌株HP10、HP9、HGD12 均屬于該細菌目，這可能是接種的芽孢桿菌屬菌株定殖到根際土壤中，或者是菌劑的施加活化了根際土壤中芽孢桿菌目的細菌所致。本研究的PGPR 菌劑中，HGD3 為假單胞菌屬菌株，雖然兩種處理的根際土壤中均未檢測到Pseudomonassp.，但有研究表明，自然界中存在某些PGPR，它們在根際土壤中的存活時間不長，但其對土壤細菌群落結構的影響不可忽視［33］。土壤微生物之間相互作用，關系錯綜復雜，加之田間土壤環境影響因素復雜多變，不同成分的微生物菌劑與土壤原住物種之間的競爭與掠食關系等［34-35］，所引起的土壤細菌消減增漲效應也有所不同。鑒于此，可通過盆栽試驗以避免復雜的田間環境因素，進一步探究根際土壤細菌對微生物菌劑的響應。

根際土壤微生物群落多樣性是提高農田土壤的穩定性、生產力和可持續性［36-38］的基礎，根際土壤微生物群落結構變化決定了作物生長狀況的優良。Ramos 等［39］研究表明，接種地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）懸浮液對歐洲榿木（Alnus glutinosa）的促生效果與根際土壤微生物的響應幅度呈正相關關系，類似的研究在意大利石松幼苗［13］和豇豆［40］上也得到了相同的結果。本文對辣椒果實產量指標與根際土壤細菌多樣性的Pearson 相關性分析發現，細菌多樣性指數與單株產量之間呈正相關性，PGPR 菌劑處理后辣椒的單株產量提升明顯，且單果重量顯著提高。PGPR 菌劑灌根后辣椒根際土壤細菌群落結構的改變可能才是辣椒產量增加和果實品質提升的最主要原因，但具體的作用和機制還需進一步通過動態觀察研究。

4 結論

通過PGPR 菌劑對辣椒進行灌根，顯著提高了辣椒根際土壤中細菌及固氮、溶磷及解鉀等功能菌群的數量，改善了辣椒根際土壤細菌的多樣性和豐度，顯著促進了辣椒產量的提升。

不同化肥量配施PGPR 菌劑，辣椒根際土壤細菌群落結構有所差異，表明化肥影響了辣椒根際土壤細菌群落結構，2 種處理組辣椒產量沒有明顯差異，且根際土壤細菌群落多樣性和豐度均高于未施菌劑組。結果表明:PGPR 菌劑配施化肥在促進辣椒增產的同時，有利于維持并改善土壤細菌多樣性，對提高土壤生產力和可持續性具有重要作用。