土壤輻照滅菌對土壤中銨態氮和硝態氮行為的影響

張昊青，趙學強，喻 敏，沈仁芳

［1．佛山科學技術學院國際膜生物學與環境研究中心，廣東 佛山 528000；2．土壤與農業可持續發展國家重點實驗室（中國科學院南京土壤研究所），江蘇 南京 210008；3．中國科學院大學，北京 100049］

氮是植物需要量最多的礦質營養元素，其在土壤中的各種行為與作物氮肥利用率、損失密切相關。例如，土壤中有機態氮的礦化分解過程決定了土壤中可被植物直接吸收利用的有效氮數量，因而影響了氮素利用效率［1-2］。土壤硝化作用消耗了土壤中的銨態氮，可以減少氨揮發損失，但其產生的硝態氮極易淋失，造成水體污染，也容易通過反硝化過程進入大氣，造成大氣污染［1，3-5］。另外，不同作物或同一作物的不同品種對銨態氮和硝態氮的偏好不一樣［6］，土壤中的銨硝轉化會影響作物的氮肥利用率［7］。因此，通過了解氮在土壤中的行為可以為提高作物的氮肥利用率和減少氮的環境損失提供理論基礎。

作為土壤氮素地球化學循環的驅動者，土壤微生物在土壤氮素轉化中起著十分重要的作用［8］。銨態氮和硝態氮是植物可以直接吸收利用的兩種主要無機氮素形態。在微生物的作用下，銨態氮和硝態氮可以相互轉化，也會通過各種途徑損失，以及被土壤微生物和土壤晶格固持。此外，土壤微生物也會通過自身代謝過程或礦化來分解土壤中有機態氮，釋放無機態氮。由此可見，土壤微生物一方面通過自身的生命活動參與氮循環，同時其本身也是土壤活性氮庫的重要組成部分。提高土壤中氮素的作物可利用性，亟需明確土壤微生物在氮素形態轉化、氮素釋放、固持及損失等過程中的作用。

目前的研究多集中于土壤氮素循環過程及其微生物機理，而土壤微生物對氮素轉化過程的貢獻缺乏定量評價。因此，本文采用土壤γ 輻照滅菌和15N 同位素示蹤相結合的手段，研究了土壤滅菌對外源施入的銨態氮和硝態氮在土壤中的相互轉化、固持、損失及其對土壤自身有機氮礦化的影響，以定量評價土壤微生物對銨態氮和硝態氮在土壤中各種行為的影響，為提高土壤氮的作物利用效率和減少土壤氮素損失提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集

供試土壤采集自江西省鷹潭市中國科學院紅壤生態試驗站旱地農田。該地區屬于典型的亞熱帶濕潤季風氣候區，水熱資源豐富，年降水量1 882 mm，年均溫18.4℃。采集0 ～20 cm 表層土壤樣品，剔除雜物后，風干，磨細，過1 mm 篩備用。該土壤樣品發育自第四紀紅粘土，土壤基本理化性質見表1。

表1 供試土壤基本理化性質

1.2 試驗設計

本試驗為室內土壤培養試驗，包含兩個因素，A 因素為不同氮形態，分別為:銨態氮和硝態氮處理；B 因素為滅菌處理，即滅菌和不滅菌處理。共4 個處理，每個處理重復3 次，隨機排列。試驗具體操作步驟如下:首先，稱取50 g 過1 mm 篩的風干土樣于12 個培養瓶中，將培養瓶等分為兩份，一份經過γ 輻照（輻照強度:30 nSv·h-1）滅菌，作為滅菌處理；另一份作為未滅菌的對照處理。再將滅菌和未滅菌的土壤分別等分兩份，一份均勻地加入15N 標記的硫酸銨［（15NH4）2SO4］溶液，一份均勻地加入15N 標記的硝酸鈉（Na15NO3）溶液，另補充一定量的去離子水以保證充足水分條件。用無菌透氣封口膜將培養瓶封口，置于25℃人工氣候室內恒溫黑暗培養。培養期間每3 d 采用稱重法補水，培養第30 d 后取樣，置于4℃冰箱保存，用于土壤硝態氮、銨態氮含量及其15N 豐度測定。

在本試驗中，氮肥的施用量均為N 200 mg ·kg-1，15N 標 記 的 肥 料 中（15NH4）2SO4的15N 豐 度 為20.18%，Na15NO3的15N 豐度為30.15%。所有處理均加入磷肥（過磷酸鈣）和鉀肥（氯化鉀）作為肥底，用量分別為P 100 mg·kg-1和K 200 mg·kg-1。

1.3 土壤理化性質分析

土壤硝態氮、銨態氮采用2 mol·L-1KCl 溶液浸提，流動分析儀（San++ System，SAKLAR，荷蘭）測定；土壤pH 值采用pH 計（PB-21，Sartorius，德國）測定，土水比為1∶2.5；土壤有效磷 采 用pH 值8.5 的0.5 mol·L-1NaHCO3溶 液 浸提，鉬銻抗比色法測定；速效鉀采用pH 值7.0 的1 mol·L-1乙酸銨溶液浸提，火焰光度法測定；有機質采用低溫外加熱重鉻酸鉀氧化-比色法測定；全氮含量采用以Se 粉、CuSO4、K2SO4為催化劑，濃H2SO4消煮，凱氏法測定。

1.4 土壤硝態氮、銨態氮及全氮的15N 豐度測定

土壤硝態氮和銨態氮15N 豐度依據曹亞澄等［9］的方法進行測定。該方法的原理是將KCl 提取液中的銨態氮和硝態氮轉化為N2O 氣體，然后用帶有預濃縮裝置的同位素比值質譜儀（MAT 253 plus，Thermo Fisher Scientific，德國）測定N2O 中的15N豐度。具體操作步驟如下:首先采用2 mol·L-1KCl 溶液浸提土壤中的硝態氮、銨態氮。測定銨態氮15N 豐度時，第一步將浸提液中的NH4+經過MgO 蒸餾或擴散成NH3，再用含有0.5 mmol·L-1CuSO4溶液的稀硫酸溶液吸收餾出液中的NH3，后加入堿性次溴酸鈉溶液將其轉化為N2O 氣體，抽取氣體樣品，測定其15N 豐度。測定硝態氮15N 豐度時，第一步加入氨基磺酸去除土壤提取液中所含的亞硝酸鹽，再將樣品注入含有50 mg 鍍銅鎘粒還原劑的醋酸緩沖液中，使提取液中的NO3-轉化為N2O，抽取氣體樣品進行測定。土壤全氮15N 豐度采用同位素質譜儀（IsoPrime 100，Elementar，德國）直接測定。

1.5 統計分析

采用SPSS 19.0 進行統計分析。使用獨立樣本t檢驗比較滅菌和不滅菌條件下施用銨態氮和硝態氮處理間差異顯著性，以及施銨或施硝條件下滅菌和不滅菌處理間差異顯著性，P＜ 0.05 為顯著。采用Sigma Plot 12.5 作圖。

1.6 計算公式

土壤中來自15N 標記肥料的硝態氮含量（mg·kg-1）=（土壤中硝態氮15N 豐度-15N 自然豐度）×總硝態氮含量/（肥料中15N 豐度-15N 自然豐度）

土壤中來自15N 標記肥料的銨態氮含量（mg·kg-1）=（土壤中銨態氮15N 豐度-15N 自然豐度）×總銨態氮含量/（肥料中15N 豐度-15N 自然豐度）

來自土壤自身的硝態氮含量（mg·kg-1）=培養結束時土壤總硝態氮含量-來自15N 標記肥料的硝態氮含量

來自土壤自身的銨態氮含量（mg·kg-1）=培養結束時土壤總銨態氮含量-來自15N 標記肥料的銨態氮含量

土壤中來自15N 標記肥料的總氮含量（mg·kg-1）=（土壤中全氮15N 豐度-15N 自然豐度）×土壤全氮含量/（肥料中15N 豐度-15N 自然豐度）

土壤固持的肥料氮（mg·kg-1）=土壤中來自15N 標記肥料的總氮含量-土壤中來自15N 標記肥料的硝態氮含量-土壤中來自15N 標記肥料的銨態氮含量

損失的肥料氮（mg·kg-1）=肥料施用量-土壤中來自15N 標記肥料的總氮含量

2 結果與分析

2.1 滅菌對土壤硝態氮、銨態氮含量的影響

圖1 結果表明，在施用銨態氮的條件下，滅菌土壤中硝態氮含量顯著低于未滅菌土壤，相反，滅菌土壤中銨態氮含量顯著高于未滅菌土壤，說明滅菌抑制了土壤硝化作用的發生。在施用硝態氮的條件下，未滅菌土壤和滅菌土壤中硝態氮含量沒有顯著差異，未滅菌土壤中銨態氮含量很低，幾乎趨近于零，而在滅菌土壤中，土壤銨態氮含量達到20.52 mg·kg-1，意味著滅菌顯著增加土壤銨態氮含量。不管是否滅菌，施用硝態氮處理的土壤硝態氮含量都高于施用銨態氮處理，施用銨態氮處理的土壤銨態氮含量都高于施用硝態氮處理（圖1）。

圖1 滅菌和氮肥處理對土壤硝態氮、銨態氮含量的影響

15N 示蹤的手段有助于定量區分土壤中來自于肥料的硝態氮、銨態氮與土壤自身的硝態氮、銨態氮。圖2 結果表明，在未滅菌土壤中，施用的200 mg·kg-1銨態氮在培養30 d 后已有50 mg·kg-1被硝化成為硝態氮，而在滅菌土壤中，施用的銨態氮肥則不會轉化成為硝態氮，因此滅菌土壤中來自肥料的銨態氮含量較未滅菌土壤顯著增加。在施用硝態氮的條件下，滅菌對來自肥料的硝態氮含量沒有顯著影響，無論是否滅菌，來自肥料的銨態氮含量均趨近于0，說明在本試驗條件下硝態氮肥并不會轉化為銨態氮。

不管施用銨態氮還是施用硝態氮，培養30 d后，與未滅菌處理相比，滅菌處理顯著降低了來自土壤自身的硝態氮含量，但是卻促進了土壤自身銨態氮的釋放（圖3）。在未滅菌條件下，施用銨態氮處理的來自土壤的硝態氮含量顯著高于施用硝態氮處理，但是在滅菌條件下，來自土壤的硝態氮含量在兩種氮肥處理之間差異不顯著。不管是否滅菌，施用銨態氮處理的來自土壤的銨態氮含量均顯著高于施用硝態氮處理，表明銨態氮肥可能刺激了土壤自身銨態氮的釋放。

圖2 滅菌和氮肥處理對土壤中來自肥料的硝態氮、銨態氮含量的影響

圖3 滅菌和氮肥處理對來自于土壤的銨態氮、硝態氮含量的影響

2.2 滅菌對肥料氮在土壤中的固持及損失的影響

施入土壤的銨態氮和硝態氮會在土壤中發生物理的、化學的和生物的反應，大部分會留在土壤中，小部分會損失到環境中。圖4 表明，培養30 d后，在未滅菌土壤中，與銨態氮相比，硝態氮在土壤中殘留較多，但在滅菌土壤中，硝態氮和銨態氮在土壤中的殘留量差異不顯著。土壤滅菌顯著降低了硝態氮在土壤中的殘留，但對銨態氮在土壤中的殘留無顯著影響。殘留在土壤中的銨態氮和硝態氮又分為兩部分，一部分可以通過2 mol·L-1KCl 溶液的方法（見材料與方法）浸提出來，另外一部分被土壤強烈吸附固定而不能被2 mol·L-1KCl 溶液浸提出來，或者被微生物同化。本文將被土壤吸附和被微生物同化的銨態氮和硝態氮稱為土壤中固持的肥料氮。通過計算銨態氮和硝態氮肥在土壤中的固持量發現，滅菌顯著降低硝態氮肥在土壤中的固持量，與不滅菌土壤相比，降低幅度近50%（圖4）。滅菌對銨態氮肥在土壤中的固持量沒有顯著影響。在未滅菌條件下，銨態氮肥和硝態氮肥在土壤中的固持量沒有顯著差異，但是滅菌后前者顯著高于后者。進一步計算肥料氮損失發現，滅菌后硝態氮肥損失顯著增加，但是對銨態氮肥損失沒有顯著影響。在未滅菌條件下，銨態氮肥損失量顯著高于硝態氮肥，滅菌處理后前者仍高于后者，但是二者之間差異不顯著（圖4）。

通過計算銨態氮、硝態氮在土壤-環境系統中的分配比例（圖5）發現，在施用銨態氮的條件下，未滅菌土壤中有25.3%的銨態氮通過硝化作用轉化成為硝態氮，26.4%被土壤晶格和土壤微生物固持，8.1%損失。而在滅菌土壤中，由于缺乏土壤微生物的驅動，幾乎沒有肥料氮轉化成為硝態氮，63.3%的肥料氮仍以銨態氮的形式存在于土壤中。同時，滅菌土壤肥料氮損失比例較未滅菌土壤有所增加。在施用硝態氮條件下，未滅菌土壤中絕大部分肥料氮（81.9%）仍以硝態氮形式存在，剩余部分（18.1%）被土壤和微生物固持，無肥料氮損失。而在滅菌土壤中，除仍以硝態氮形式殘留的肥料氮（88.7%）外，僅有9.3%被固持，其余1.8%被損失。

圖4 土壤滅菌對外源施入肥料在土壤中的殘留、固持及損失的影響

圖5 土壤滅菌對肥料氮在土壤-環境體系中的分配比例

3 討論

3.1 15N 標記的銨態氮和硝態氮在土壤中的相互轉化

硝化作用是指在硝化微生物參與下將銨態氮轉化成為硝態氮的過程。在本研究中，當15N 標記的銨態氮肥施入未滅菌土壤中，培養30 d 后有25.3%的銨態氮轉化為硝態氮，說明該土壤硝化作用較強。而在滅菌土壤中，施用銨態氮處理幾乎沒有標記的硝態氮產生，這意味著輻照滅菌土壤培養30 d后，土壤硝化作用近乎停止，暗示著硝化微生物的生長和活性可能被完全抑制。前人研究發現，不同的滅菌方式對土壤中硝化作用抑制的效果不同。通過熏蒸滅菌的方式可以在短期內抑制土壤中硝化微生物的活性，但當熏蒸脅迫解除，熏蒸的抑制效果消失［10］。高溫蒸汽滅菌可以在土壤未被擾動的條件下持續80 d 顯著抑制土壤硝化作用，若多次對土壤進行擾動取樣，則抑制作用減弱［11］。因此，在通過滅菌手段研究土壤微生物功能時，應合理選擇滅菌方式和取樣方式。本研究結果表明，若僅在培養結束后取樣，γ 射線輻照滅菌對土壤硝化微生物的抑制作用較強且持續時間較長，是微生物研究中土壤滅菌的較優選擇。

當15N 標記的硝態氮肥施入土壤中，無論是否滅菌，土壤中被標記的銨態氮含量均趨近于零，說明在此試驗條件下，無論是否有微生物的存在，施用的硝態氮均不會轉化成為銨態氮。據報道，硝態氮異化還原成氨的過程易在厭氧或低氧狀態下發生［12］。本試驗全程保持通氣狀態且水分含量適中，因此即使是在微生物存在的情況下，也很難發生硝態氮的異化還原過程。

3.2 滅菌和外源投入銨、硝對土壤自身氮素礦化的影響

本研究結果表明，在未滅菌土壤中外源添加銨態氮培養30 d 后，來自土壤自身的銨態氮與硝態氮之和為75.7 mg·kg-1，高于滅菌土壤（51.32 mg·kg-1）；添加硝態氮培養30 d 后，來自土壤自身的銨態氮與硝態氮之和為40.3 mg·kg-1，同樣高于滅菌土壤（24.2 mg·kg-1）。說明在微生物存在的條件下，土壤中有機氮的礦化能力較強，更有利于土壤自身無機氮的釋放。同時也發現，與施用硝態氮相比，在未滅菌土壤中外源添加銨態氮后土壤自身銨態氮和硝態氮的釋放量顯著增加，說明外加銨態氮比外加硝態氮對土壤有機態氮的礦化作用顯著，這與呂殿青等［13］的研究結果相似。這一結果也說明，選擇微生物較易同化的氮源可促進土壤自身有機態氮的礦化，為植物生長提供充足營養［14］。

當土壤滅菌后，由于硝化作用被完全抑制，施用銨態氮處理來自于土壤自身的硝態氮含量與試驗初始值相似。值得注意的是，若滅菌條件下完全不存在氮素轉化過程，則滅菌后來自土壤自身的銨態氮含量也應保持與初始值相似。但在本研究中，滅菌條件下施銨處理來自土壤自身的銨態氮含量較初始值有近48 mg·kg-1的增加，施硝處理來自土壤自身的銨態氮含量也有25 mg·kg-1的增加。說明無論施入何種形態氮肥，滅菌都會提高來自土壤自身的銨態氮含量，許多研究也發現了這一現象［15-16］。一方面原因可能是由于在滅菌的過程中微生物死亡進而釋放出銨；另一方面，滅菌也在一定程度上有助于腐植質的分解和礦化，進而釋放出少量的銨態氮［17］。也有研究表明，經過輻照后，部分微生物盡管不再增殖，但仍可能具有生物化學活性［17］。γ 射線可產生游離的氫和羥基，這些自由基具有很強的活性，并且可通過反應裂解土壤的C-C 鍵導致土壤有機碳的分解，土壤中溶解性有機碳濃度增加，進而可為存留下來的微生物提供良好環境［15］。因此，經過滅菌，土壤中可能仍存在有機氮的礦化過程，這可能也是滅菌土壤培養30 d后來自土壤自身銨態氮相比試驗前增加的原因。但是，也有研究發現，γ 射線滅菌降低了土壤中堿解氮的含量［18］。這可能與土壤有機質含量有關。有機質含量較高的土壤更有利于營養元素的釋放［19］。在倪國榮等［18］研究中，試驗用土的有機質含量為2%，低于本研究土壤有機質含量3.6%，因此造成研究結果的差異。

3.3 15N 標記的銨態氮和硝態氮在土壤中的固持

本研究表明，當15N 標記的銨態氮施入土壤中，滅菌和未滅菌條件下土壤對銨態氮的固持量基本一致，證明即使在沒有或缺乏微生物的條件下，土壤也能通過非生物途徑固持26%的銨態氮。這與Davidson 等［20］的研究結果相似。一方面，土壤膠體帶負電，對帶正電的銨態氮具有很強的吸附作用［3］；另一方面，土壤有機質也可吸附一小部分游離的銨根離子［20］。而當15N 標記的硝態氮施入土壤中時，滅菌土壤中被固持的肥料氮顯著低于未滅菌土壤，證明微生物有助于硝態氮在土壤中的固持。這與普遍認為的微生物主要固持銨態氮而對硝態氮的固持作用較弱的觀點不一致［21-22］。原因可能是由于本研究供試土壤采集自旱地農田，這種土壤中由于硝化作用較強，氮素形態一般以硝態氮為主，而土壤中又存在著硝化細菌和異養微生物對銨態氮的強烈競爭作用。若土壤中銨態氮的含量不足以滿足微生物的需求，硝態氮就有可能被微生物所同化［23］。另外一方面，與銨態氮相比，微生物同化硝態氮需要更多的能量。在部分土壤中，有效態碳的數量可能是限制微生物同化硝態氮的主要因素［24］。本研究供試土壤的有機質含量較高，可為微生物提供充足碳源，因此，在本研究中，微生物對硝態氮在土壤中的固持具有重要作用。值得注意的是，盡管滅菌顯著降低了土壤中固持的硝態氮數量，但仍有9.3%的硝態氮肥被固持。說明在本研究供試土壤中也發生了硝態氮的非生物固持。原因可能是由于該土壤發育自第四紀紅粘土，含有大量表面帶正電荷的鐵鋁氧化物，而對硝酸根有較強的吸附能力［25］。

3.4 15N 標記的銨態氮和硝態氮在土壤中的損失

在本研究土壤純培養體系中，氮素不可能流失或淋失，只可能通過氣態方式損失。對于銨態氮，氨揮發是主要損失途徑，對于硝態氮，反硝化是主要損失途徑。氨揮發是指土壤中的銨根離子與土壤中的水結合生成液相的氨分子，最終轉化為氣態的氨，損失進入大氣的過程。該過程是物理化學過程。在本研究中，無論是否滅菌，均有10%左右的銨態氮肥損失進入大氣。但是，在未滅菌的土壤中，施入的硝態氮并未損失，這可能是因為反硝化過程易在厭氧或低氧條件下發生［12］。本研究在培養過程中通氣狀況良好，基本不會有反硝化過程發生。而在滅菌土壤中，由于微生物固持的肥料氮的降低，硝態氮損失增加，造成損失的原因可能與一些非生物途徑有關。本研究在室內進行，培養條件控制嚴格，如果在田間，微生物固持氮的能力降低很容易造成硝態氮的淋溶及反硝化損失，對大氣和水體環境構成威脅。

4 結論

總體來看，土壤滅菌抑制了銨態氮向硝態氮的轉化，并促進了土壤自身銨態氮的釋放，卻顯著降低了土壤對硝態氮的固持，增加了硝態氮的損失。因此，滅菌有利于銨態氮的累積，而降低硝態氮的累積。與外源添加硝態氮相比，外源添加銨態氮更有利于土壤自身銨態氮的釋放及其在土壤中的固持，卻在一定程度上增加了氮素損失。在今后研究中，還需與植物吸收相結合，通過調控土壤氮素轉化過程以提高植物的氮素利用效率。