微弧氧化羥基磷灰石涂層金屬鈦調控Wnt通路促進骨髓間充質干細胞的增殖*

王艷玲， 邵 喆， 何 巍， 朱蘭省

1河南省中醫院(河南中醫藥大學第二附屬醫院)口腔科，鄭州 4500022武漢大學口腔醫院口腔頜面外科，武漢 430079 3鄭州大學第一附屬醫院口腔科，鄭州 450052

種植體植入口腔后，其種植成功與否取決于種植體骨結合是否成功。種植體骨結合是牙槽骨不斷改建和吸收的動態改建過程，其中起源于骨髓間充質干細胞(bone marrow stromal cells，BMSC)的成骨細胞起到極其重要的作用[1]。BMSC是一種多能干細胞，具有自我更新增殖和多向分化的能力，并且可以分化為成骨細胞而促進種植體與骨更好地結合[2]。種植體與BMSC共同移植可以發揮BMSC自我更新的潛能，通過自我增殖產生更多的BMSC，從而可以分化為更多的成骨細胞而促進骨結合。

金屬鈦和其合金因具有良好的生物相容性和機械性能而被廣泛應用于口腔種植體和骨科領域的研究中[3]。金屬鈦表面的特性對于其生物相容性至關重要，通過改變其表面特性可以改善其對細胞的相容性，可以促進細胞粘附和組織再生[4]。目前羥基磷灰石(HA)涂層被認為是提升金屬鈦生物相容性的良好表面涂層。其可以作為橋梁連接金屬與正常骨組織，同時可以誘導BMSC向成骨細胞分化和新生骨形成[5]。目前主要有2種制備HA涂層的方式，分別為普通電化學法(ELC)和微弧氧化法(MAO)。本研究旨在探究2種方式制備的金屬鈦材料對BMSC的粘附和增殖的影響，從而為研發性能更佳的種植體提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 微弧氧化HA涂層與電化學HA涂層制備

金屬鈦薄片(10 mm×10 mm×1 mm，寶雞英耐特醫用鈦有限公司)充分打磨、拋光后備用，分別使用MAO法和ELC法制備HA涂層金屬鈦。MAO法：金屬鈦片浸沒于納米摻鍶羥基磷灰石涂層組電解液之中，陽極為金屬鈦，陰極為不銹鋼片，恒壓(350 V)電解5 min，頻率50 Hz，占空比50%，最后得到MAO-HA涂層金屬鈦片。ELC法：金屬鈦片置于電解液(3 mmol/L Ca(NO3)2、1.75 mmol/L NH4H2PO4、0.1 mmol/L NaCl、pH6.0)中，陽極為金屬鉑片，陰極為金屬鈦片，保持電流強度10 mA，電泳溫度85℃，電泳1 h。隨后得到ELC-HA涂層金屬鈦片。

1.2 BMSC培養

BMSC取自200 g成年雌性Wistar大鼠(10只，河南中醫藥大學動物中心提供)。使用冷乙醇(75%)浸泡脫頸處死的大鼠10 min。嚴格無菌操作條件下取大鼠股骨、脛骨和肱骨等長骨，置于DMEM中。切斷長骨干骺端，使用無菌注射器抽吸DMEM培養液沖洗長骨髓腔。隨后收集沖洗下的細胞，1000 r/min離心5 min。使用DMEM(含10% FBS)重懸細胞并種植于6孔板中。12 h換液，移除漂浮細胞，之后每隔3天換液1次。使用第3代的BMSC進行后續實驗，鋪板密度為1×107/L。細胞分為2組：ELC組加入ELC-HA涂層金屬鈦片，MAO組加入MAO-HA涂層金屬鈦片，每組設置4個復孔(n=4)。

1.3 BMSC免疫熒光染色鑒定

將細胞培養板中的BMSC培養液移除，冷PBS清洗細胞，多聚甲醛(4%)固定10 min，0.3% Triton X-100滲透10 min，PBS清洗細胞后，使用封閉血清封閉過夜。PBS清洗細胞后使用BSA(1%)稀釋的一抗(CD29和CD90)4℃條件下孵育過夜。隨后加入熒光二抗孵育2 h。PBS清洗細胞后加入DPAI細胞核染液孵育10 min，封片，拍照。

1.4 2種涂層的水滴接觸角檢測

將1.0～2.0 μL雙蒸水滴于材料上，水滴與材料的接觸角使用SDC-100測量儀(聚創時代中國)進行觀察和記錄。

1.5 掃描電鏡觀察

使用掃描電鏡觀察MAO組和ELC組材料表面形態，同時觀察在金屬片上培養48 h的BMSC形態，觀察材料對細胞粘附性的影響。吸出細胞的培養液，平衡鹽溶液清洗細胞后加入電鏡固定液(戊二醛，2.5%)固定1～2 h。使用PBS再次清洗細胞及金屬板3次，隨后鋨酸固定(1%，4℃，1 h)。乙醇脫水(脫水乙醇濃度依次為30%、50%、70%、90%、100%，每個濃度脫水15 min)，干燥、噴金，隨后拍照。

1.6 CCK-8法檢測細胞增殖

細胞培養板中放置ELC和MAO方法制備的金屬圓片材料(直徑略小于培養孔直徑)，將BMSC鋪在底部為材料的孔板中，鋪板后24、48、72 h使用CCK-8試劑盒(碧云天，中國)檢測兩組細胞增殖。吸棄培養液，平衡鹽溶液清洗細胞和金屬片，加入CCK-8試劑后37℃培養箱繼續培養4 h，隨后吸取100 μL樣品液放入新的96孔板中，進而檢測各組樣品在450 nm波長處的吸光度值。以各組吸光度值與ECL 24 h組吸光度值的比值反映各組細胞增殖情況。

1.7 Western blot法檢測Wnt通路蛋白表達

為了檢測MAO-HA涂層金屬鈦材料調控BMSC增殖是否通過Wnt通路，在培養72 h后收集MAO組和ELC組細胞并使用Western blot法檢測Wnt-3a、β-catenin、GSK3β和p-GSK3β蛋白的表達。收集細胞，使用平衡鹽溶液清洗細胞，隨后加入細胞裂解液和蛋白酶抑制劑(碧云天公司)。對各個樣本蛋白濃度進行定量(BCA試劑盒，碧云天公司)。SDS-PAGE(10%)凝膠電泳分離樣品蛋白，轉移到PVDF膜上，使用脫脂奶粉(5%)封閉后分別孵育一抗(Wnt-3a、β-catenin、GSK3β和p-GSK3β(Abcam公司)和辣根過氧化物酶標記二抗(Goat-anti-Rabbit-IgG-H&L-HRP)。采用ECL法顯影，GAPDH作為內參，以目的蛋白與內參條帶的吸光度比值反映蛋白的表達量。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 親水性檢測

首先對ELC組和MAO組材料的親水性進行檢測，比較水滴滴在材料表面形成的接觸角，當接觸角越小時，證明材料親水性越好。結果顯示ELC組的接觸角為(73.0±1.5)°，MAO組的接觸角為(50.1±1.9)°，兩組比較差異具有統計學意義(P<0.01)，說明MAO涂層材料具有更好的親水性(圖1)。

A：ELC組水滴接觸形態與接觸角；B：MAO組水滴接觸形態與接觸角；C：兩組接觸角統計分析，*P<0.01圖1 ELC組與MAO組材料親水性比較Fig.1 Comparison of hydrophilicity between ELC group and MAO group

2.2 BMSC鑒定

培養的BMSC均勻生長，呈多角形和梭形，細胞充分伸展并平鋪于細胞培養板中。細胞免疫熒光染色顯示培養的BMSC細胞呈CD90(紅色)陽性和CD29(綠色)陽性，細胞同時表達BMSC特異性標志物CD90和CD29，證實所培養的細胞為BMSC(圖2)。

A：CD90；B：CD29；C：DAPI；D：融合圖圖2 BMSC細胞免疫熒光染色鑒定(×200)Fig.2 Immunofluorescence staining for identification of BMSC cells(×200)

2.3 掃描電鏡下觀察BMSC在ELC-HA涂層和MAO-HA涂層材料表面生長的形態

對ELC-HA涂層材料和MAO-HA涂層材料表面的微觀地形進行掃描電鏡檢測，結果顯示MAO組涂層材料表面具有較均勻的粗糙孔隙，而ELC組材料表面較平滑(圖3)。而BMSC在MAO組細胞充分伸展，突起粗大，而ELC組細胞與材料貼合不完全，細胞較小，突起較細，證實MAO涂層材料更適合BMSC粘附和生長(圖4)。

A、B：ELC組；C、D：MAO組；A、C：放大300倍，B、D：放大10000倍圖3 掃描電鏡觀察兩組材料的表面地形Fig.3 Surface topography of the materials between the two groups by SEM

A：ELC組；B：MAO組圖4 掃描電鏡下觀察BMSC在兩組材料上的生長情況Fig.4 Growth of BMSC in two groups observed by SEM

2.4 兩組材料對BMSC增殖的影響

檢測ELC-HA涂層材料和MAO-HA涂層材料對BMSC增殖的影響。使用CCK-8方法檢測在兩組材料上培養24、48和72 h后細胞增殖情況。結果顯示(圖5)：ELC組和MAO組BMSC細胞均隨著時間延長而增殖，在24 h時間點兩組增殖情況無明顯差異，而在48 h和72 h，MAO組細胞增殖顯著優于ELC組，且差異具有統計學意義(P<0.05)。證實相比于ELC-HA涂層材料，MAO-HA涂層材料具有更佳的促進BMSC增殖的特性。

2.5 MAO-HA涂層材料對BMSC細胞Wnt通路的調控作用

為了驗證MAO-HA涂層材料調控BMSC細胞增殖的內在通路和機制，采用Western blot法檢測Wnt通路關鍵蛋白Wnt-3a、β-catenin、GSK3β和p-GSK3β在Control組、ELC組和MAO組BMSC細胞中的表達水平。結果顯示(圖6)：相比于ELC組，Wnt-3a、β-catenin和p-GSK3β在MAO組的表達均顯著上調(均P<0.05)，而總GSK3β在兩組表達水平相當。結果證實MAO-HA涂層材料可以調控BMSC中Wnt通路。

*P<0.05圖5 ELC組和MAO組材料對BMSC細胞增殖的影響Fig.5 Effect of materials of ELC group and MAO group on BMSC proliferation

A：Western blot檢測結果灰度圖；B：Wnt-3a蛋白表達量柱狀統計圖；C：p-GSK3β蛋白相對表達量統計柱狀圖；D：GSK3β蛋白相對表達量統計柱狀圖；E：β-catenin蛋白相對表達量統計柱狀圖；與Control組比較，*P<0.05；與ELC組比較，#P<0.05圖6 Control組、ELC組和MAO組材料對Wnt通路的調控作用Fig.6 Regulatory effect of materials of Control group，ELC group and MAO group on Wnt pathway

3 討論

種植體植入的成功與否與骨結合密不可分，成骨細胞的粘附是骨結合的第一步，成骨細胞來源于BMSC。作為決定骨結合是否完全的種子細胞，BMSC的數量直接決定可以促進骨結合的成骨細胞的數量，最終影響種植體骨結合。因此，找到性能更佳、促進BMSC粘附和增殖的種植體材料對于種植體植入的成功尤為重要。本研究比較了ELC涂層材料和MAO涂層材料對BMSC粘附、增殖和Wnt通路的影響。結果顯示，MAO材料具有更優的表面地形，具有良好的親水性，更適于BMSC細胞在其表面生長。MAO材料顯著促進了BMSC的增殖，Wnt通路蛋白檢測發現MAO可以調控BMSC細胞中Wnt通路而促進細胞增殖。

GSK3β是Wnt通路重要的關鍵蛋白，是一種調節細胞代謝的激酶[6-7]。β-catenin是Wnt通路下游關鍵功能性蛋白，由細胞質進入細胞核后發揮功能，可以調節BMSC成骨分化[8]。GSK3β可以通過結合β-catenin而抑制Wnt信號通路的激活，磷酸化后的GSK3β(p-GSK3β)失去結合活性而導致Wnt通路激活[9]。有研究表明使用鋰可以抑制GSK3β活性從而激活Wnt通路[10]。Wnt通路參與到骨骼發育和修復過程中，同時也參與到干細胞的增殖和分化中[11]。有研究顯示Wnt信號通路配體蛋白與羥基磷灰石(HA)共同移植可以顯著促進種植體周圍骨形成[12]。本研究結果顯示MAO-HA涂層材料可以抑制GSK3β活性和提高β-catenin表達，從而激活Wnt通路，促進BMSC細胞增殖。

綜上所述，本研究證實了MAO-HA涂層金屬鈦材料具有良好的親水性，適于BMSC細胞在其表面生長，可以激活Wnt通路，促進BMSC細胞增殖。提示MAO-HA涂層金屬鈦材料可以作為一種生物相容性良好的材料用于制作骨結合能力更好的種植體，從而增加種植體置入的穩定性和成功率。