孕激素對白假絲酵母菌刺激的小鼠腹腔巨噬細胞NLRP3炎性體表達的影響*

許 莉， 陳 娜

武漢市第一醫院皮膚科，武漢 430022

外陰陰道假絲酵母菌病(vulvovaginal candidiasis，VVC)是一種常見的陰道黏膜真菌感染性疾病，白假絲酵母菌是最常見的致病菌。VVC的主要癥狀為外陰瘙癢，陰道灼熱感，部分患者陰道分泌物增多，呈白色凝乳或豆渣樣，可通過性接觸傳染[1]。約75%育齡婦女在一生中至少感染一次VVC，其中約半數病例出現再次發作，5%病例最終發展為復發性VVC[1]。有研究發現孕婦陰道假絲酵母菌病發病率增高，而妊娠增加宿主對細菌、病毒、真菌的易感性可能與孕激素水平增高導致的免疫抑制效應有關[2]。但孕激素是通過何種途徑下調機體的免疫應答，發揮免疫抑制作用，并最終導致假絲酵母菌感染的發生，至今仍未闡明。NLRP3炎性體是一類大分子蛋白質，它可激活半胱天冬酶-1(Caspase-1)，進而促進促炎細胞因子白細胞介素(IL)-1β、IL-18剪切為成熟的IL-1β、IL-18并分泌，在天然免疫、獲得性免疫反應中發揮重要作用[3]。IL-1β是一種具有多種免疫調節功能的炎性細胞因子，它可通過誘發炎性反應及機體的防御反應而參與抗白假絲酵母菌免疫反應[4]。IL-18又稱IFN-γ誘導因子，主要由巨噬細胞產生，可誘導T細胞和NK細胞產生IFN-γ，在抗真菌感染中發揮重要作用[5]。Simitsopoulou等[6]發現白假絲酵母菌通過核因子(NF)-κB活化途徑誘導人外周血單核細胞NLRP3表達的增加。此外，有研究顯示孕激素可下調NF-κB的表達和活性[7]。我們猜測孕激素可能通過調節NF-κB活性，進而影響白假絲酵母菌刺激的巨噬細胞NLRP3表達及IL-1β、IL-18分泌。本研究觀察孕激素對白假絲酵母菌刺激后小鼠腹腔巨噬細胞內NLRP3炎性體表達及炎性細胞因子IL-1β、IL-18分泌的影響，探討孕激素在白假絲酵母菌感染中的免疫抑制機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RPMI 1640培養液(Gibco)，小牛血清(杭州四季青生物工程公司)，孕酮(Sigma)，Trizol(Invitrogen)，逆轉錄試劑盒(TOYOBO)，SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa)，anti-NLRP3抗體(Abcam)，anti-NF-κB p65單抗(Santa)，anti-Caspase-1 p20單抗(Santa)，IL-1β ELISA試劑盒(Abcam)，IL-18 ELISA試劑盒(Abcam)。

1.2 菌株

所用白假絲酵母菌為澳大利亞悉尼Westmead醫院感染性疾病和微生物研究中心提供的標準菌株ATCC10231。實驗前1 d將白假絲酵母菌轉種到新鮮的沙氏培養基上培養24 h后，取半環菌落于滅菌的PBS中，1500 r/min離心8 min，PBS洗滌2次，再用含小牛血清的RPMI 1640培養液將白假絲酵母菌調成106CFU/mL的懸液備用，錐蟲藍染色證實活細胞數>95%。

1.3 小鼠腹腔巨噬細胞體外培養及處理

雌性BALB/c小鼠(6～8周齡，體質量18～20 g)由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供。常規提取小鼠腹腔巨噬細胞，按2×105/cm2接種于6孔板中，每孔加入2 mL含10%小牛血清的RPMI 1640培養液，置37℃、5%CO2培養箱中培養。待巨噬細胞貼壁后，更換培養液，將細胞分為5個實驗組。①空白對照組：用含10%小牛血清的RPMI 1640培養液培養8 h；②白假絲酵母菌組：加入106CFU/mL白假絲酵母菌懸液作用巨噬細胞8 h；③白假絲酵母菌+1×10-9mol/L孕酮組：預先用1×10-9mol/L孕酮作用巨噬細胞2 h，再加入106CFU/mL白假絲酵母菌懸液作用巨噬細胞8 h；④白假絲酵母菌+1×10-8mol/L孕酮組：預先用1×10-8mol/L孕酮作用巨噬細胞2 h，再加入106CFU/mL白假絲酵母菌懸液作用巨噬細胞8 h；⑤白假絲酵母菌+1×10-7mol/L孕酮組：預先用1×10-7mol/L孕酮作用巨噬細胞2 h，再加入106CFU/mL白假絲酵母菌懸液作用巨噬細胞8 h。

1.4 實時熒光定量PCR檢測細胞中NLRP3 mRNA表達

用Trizol試劑提取巨噬細胞總RNA，每組取1 μg總RNA逆轉錄成為cDNA。取1 μL cDNA產物進行PCR反應。RT-PCR所用引物序列如下，NLRP3上游：5′-AAGCAGCAGATGGAGACTGGAAA-3’，下游：5′-TGAACAGAGCCCTGGCAGGTAG-3′，擴增產物為149 bp；內參β-actin上游：5′-TTCCTTCTTGGGTATGGAAT-3′，下游：5′-GAGCAATGATCTTGATCTTC-3′，擴增產物為203 bp。

1.5 Western blot檢測NLRP3、Caspase-1 p20和NF-κB p65蛋白表達

分別提取培養的巨噬細胞的胞核蛋白和胞質蛋白。提取的胞核蛋白用作NF-κB p65蛋白Western blot分析，胞質蛋白用作NLRP3和Caspase-1 p20蛋白Western blot分析。取各組不同組分蛋白樣品經10% SDS-PAGE電泳分離，然后將目的蛋白轉至PVDF膜上。加入稀釋后的一抗4℃孵育過夜，洗膜3次后加入稀釋的HRP標記的二抗37℃孵育2 h，洗膜3次后用DAB緩沖液避光顯色。

1.6 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞培養上清中IL-1β、IL-18含量

嚴格按照試劑盒說明書進行操作，實驗完成后使用酶標儀在450 nm處讀取樣本的吸光度值(A450nm)，依據制作的標準曲線，間接法計算各組樣本的IL-1β、IL-18含量。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 巨噬細胞內NLRP3 mRNA表達的變化

加入白假絲酵母菌刺激小鼠腹腔巨噬細胞8 h，細胞內NLRP3 mRNA的表達水平較空白對照組升高(P<0.01)。加入孕酮預處理2 h后，細胞內NLRP3 mRNA的表達水平隨著孕酮作用濃度的升高而逐漸降低。1×10-7mol/L及1×10-8mol/L孕酮可以明顯降低白假絲酵母菌引起的巨噬細胞內NLRP3 mRNA表達增加，與白假絲酵母菌組比較，差異均有統計學意義(均P<0.01)，見圖1。

1：空白對照組；2：白假絲酵母菌組；3：白假絲酵母菌+1×10-9mol/L孕酮組；4：白假絲酵母菌+1×10-8mol/L孕酮組；5：白假絲酵母菌+1×10-7mol/L孕酮組；與空白對照組比較，*P<0.01；與白假絲酵母菌組比較，#P<0.01圖1 熒光定量PCR檢測小鼠腹腔巨噬細胞NLRP3 mRNA表達Fig.1 Detection of NLRP3 in murine peritoneal macrophages by real-time PCR

2.2 巨噬細胞內NLRP3、Caspase-1 p20和NF-κB p65蛋白表達的變化

不同組別小鼠腹腔巨噬細胞Western blot結果顯示，白假絲酵母菌組細胞內NLRP3、Caspase-1 p20和NF-κB p65蛋白表達水平較空白對照組均明顯增加，分別為其6.21倍、5.50倍和4.86倍。加入孕酮預處理2 h后，細胞內NLRP3、Caspase-1 p20和NF-κB p65蛋白表達水平隨著孕酮作用濃度的升高而逐漸降低。加入1×10-7mol/L或1×10-8mol/L孕酮可以明顯降低白假絲酵母菌刺激引起的巨噬細胞內NLRP3、Caspase-1 p20和NF-κB p65蛋白表達水平升高，與白假絲酵母菌組比較，差異有統計學意義(均P<0.01)(圖2、3)。

2.3 培養上清中細胞因子IL-1β、IL-18含量的變化

加入白假絲酵母菌刺激小鼠腹腔巨噬細胞8 h，細胞培養上清中IL-1β、IL-18含量均較空白對照組升高，差異有統計學意義(均P<0.01)。加入孕酮預處理2 h后，細胞培養上清中IL-1β、IL-18水平隨著孕酮作用濃度的升高而逐漸降低。加入1×10-7mol/L或1×10-8mol/L孕酮可以明顯降低白假絲酵母菌刺激引起的巨噬細胞IL-1β、IL-18分泌，與白假絲酵母菌組比較，差異有統計學意義(均P<0.01)(表1)。

1：空白對照組；2：白假絲酵母菌組；3：白假絲酵母菌+1×10-9mol/L孕酮組；4：白假絲酵母菌+1×10-8mol/L孕酮組；5：白假絲酵母菌+1×10-7mol/L孕酮組圖2 免疫印跡法檢測巨噬細胞內NLRP3、Caspase-1 p20、NF-κB p65蛋白表達Fig.2 Detection of NLRP3，Caspase-1 p20 and NF-κB p65 in murine peritoneal macrophages by Western blotting

1：空白對照組；2：白假絲酵母菌組；3：白假絲酵母菌+1×10-9mol/L孕酮組；4：白假絲酵母菌+1×10-8mol/L孕酮組；5：白假絲酵母菌+1×10-7mol/L孕酮組；與空白對照組比較，*P<0.01；與白假絲酵母菌組比較，#P<0.01圖3 NLRP3、Caspase-1 p20、NF-κB p65蛋白表達統計結果Fig.3 Comparison of NLRP3，Caspase-1 p20 and NF-κB p65 protein expression levels among different groups

表1 培養上清中細胞因子IL-1β、IL-18含量的變化Table 1 The levels of IL-1β and IL-18 in the

3 討論

NLRP3炎性體是由核苷酸結合寡聚化結構域樣受體家族成員NLRP3、接頭蛋白ASC和效應蛋白Caspase-1組成的一種分子量約為700 kD的大分子多蛋白復合體，在細胞質內發揮外源性微生物或內源性危險信號感受器的作用，是Caspase-1活化所必需的反應平臺[3]。NLRP3炎性體組裝并激活，將無活性的Caspase-1前體轉化為活性Caspase-1，活化的Caspase-1可將不活躍的IL-1β、IL-18前體加工成成熟的促炎細胞因子并分泌，引起炎癥反應[3]。本實驗中，我們發現，給予白假絲酵母菌刺激后小鼠腹腔巨噬細胞NLRP3 mRNA表達顯著增加，胞質內NLRP3蛋白表達及活化形式的Caspase-1 p20蛋白表達也顯著增加，細胞上清中IL-1β、IL-18的分泌亦相應地顯著增加。實驗結果表明，在白假絲酵母菌感染小鼠腹腔巨噬細胞的體外模型中，NLRP3炎性體參與了Caspase-1的活化及炎性細胞因子IL-1β、IL-18的分泌。在白假絲酵母菌感染中，IL-1β作為一種重要的促炎反應介質，可以活化T細胞并間接活化B細胞、提高粘附分子表達、誘導一系列其它促炎性細胞因子以及炎性相關蛋白表達，形成炎性反應的放大級聯反應，增強機體的抗真菌免疫反應及組織損傷過程[4]。Borghi等[5]發現復發性VVC患者陰道分泌物中IL-18水平低于健康對照者，IL-18缺乏可導致VVC易感性增加和Th17/Treg失衡，提示IL-18可能在宿主防御假絲酵母菌感染中發揮了重要作用。

孕激素與VVC關系非常密切，在黃體期的女性及孕婦容易感染假絲酵母菌性陰道炎[8]。妊娠期間孕婦體內高性激素水平導致陰道組織內糖原增多，為假絲酵母菌的生長和繁殖提供了良好的碳源，可導致VVC反復發作且癥狀嚴重[8]。已有研究發現假絲酵母菌存在類固醇結合蛋白，孕激素可促進假絲酵母菌形成假菌絲，耐藥基因活化可使其毒力增強[9]。這些都說明孕激素對機體具有免疫調節功能，能影響宿主對假絲酵母菌的易感性及炎癥反應。

NF-κB是一種重要的多功能核轉錄因子，最常見的活化形式是NF-κB p65，它激活后參與眾多基因的轉錄調控，可誘導多種細胞因子、粘附分子、趨化因子等的表達[10]。孕激素主要是通過孕激素作用元件與NF-κB的相互作用引起免疫抑制效應，孕激素預處理能有效地抑制NF-κB p65亞基的核轉位，且NF-κB p65亞基核轉位的抑制反映了NF-κB活性的下降[11]。本實驗中，加入不同濃度的孕酮預處理后，隨著孕酮濃度的增加，白假絲酵母菌刺激小鼠腹腔巨噬細胞的NLRP3 mRNA表達水平，胞質內NLRP3蛋白和活化形式的Caspase-1 p20蛋白表達以及細胞上清中IL-1β、IL-18的分泌均逐漸降低，且這種逐漸降低的趨勢與胞核內NF-κB p65蛋白的逐漸減少趨勢一致。這表明孕酮可抑制白假絲酵母菌刺激引起的巨噬細胞NLRP3表達及IL-1β、IL-18分泌，且這種抑制作用可能是通過抑制NF-κB活性實現的。

在本研究中我們發現，在白假絲酵母菌感染時NLRP3炎性體的活化參與了炎性細胞因子IL-1β、IL-18的分泌，孕激素可以抑制NLRP3表達水平及炎性細胞因子IL-1β、IL-18分泌，且孕激素對NLRP3的抑制作用可能與其抑制NF-κB活性有關。這為解釋孕激素在VVC婦女發病中的免疫調節機制提供了一定的科學依據。