迷走神經刺激活化膽堿能抗炎通路對創傷/失血性休克的干預作用

鄭紫磊 郭睿 郜思齊 張立民 張玉平

創傷/失血性休克(trauma/hemorrhagic shock，T/HS)是一種有效循環血量急劇降低引起的全身組織器官低灌注為特征的臨床常見危重狀態[1]。T/HS后的低灌注導致全身組織缺血、缺氧，觸發全身失控性炎性反應，進而出現多器官功能障礙或衰竭甚至死亡。盡管現代醫學的迅速發展使得各種治療方案和器官支持措施得以廣泛應用，但T/HS引起的病死率仍然高達20%～40%[2]。2000年Borovikova等[3]首次報道，電刺激迷走神經可顯著抑制膿毒癥時體內過度活化的炎性反應，延緩休克的發生。這一發現使我們認識到，中樞神經系統通過膽堿能迷走神經可對機體免疫平衡進行快速、精準調控[4]。膽堿能抗炎通路的發現在中樞神經系統和免疫功能之間建立了直接聯系，機體通過膽堿能抗炎通路像神經反射一樣快速調控機體的免疫平衡。T/HS后出現的全身失控性炎性反應被認為是推動病情進展的關鍵環節，通過各種刺激措施使迷走神經活性增加，是否可以壓制全身失控的炎性反應、改善預后，已經越來越引起人們的注意。本文從膽堿能抗炎通路的解剖組成、功能特點、以及迷走神經刺激活化膽堿能抗炎通路對T/HS的影響進行綜述。

1 膽堿能抗炎通路完成的抗炎反射

中樞神經系統通過神經回路可能像控制身體運動、心臟節律和身體溫度一樣，控制機體炎性因子的釋放，調節免疫平衡。但是，迄今為止我們對于這種快速的神經反射樣中樞免疫調控機制知之甚少。

Borovikova等[3]首先報道，電刺激加強迷走神經活性可以顯著抑制脂多糖攻擊大鼠體內TNF的水平，進而延緩休克的發生；體外，迷走神經遞質乙酰膽堿可以抑制脂多糖攻擊巨噬細胞炎性介質的釋放。研究顯示，煙堿型乙酰膽堿受體是介導巨噬細胞產生炎性因子的關鍵，而其中最重要的是α7煙堿樣乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor-α7，α7 nAChR)[5]。隨后的研究發現，選擇性膽堿能受體激動劑尼古丁可抑制體外培養巨噬細胞核內HMGB1向胞漿異位，減少向胞外分泌；尼古丁可通過抑制NF-κB活化降低膿毒癥小鼠體內HMGB1水平，對小鼠提供長效保護；迷走神經刺激對脂多糖攻擊引起TNF釋放的抑制效應，在α7 nAChR基因敲除小鼠和施行迷走神經切斷術后消失[4,6,7]。隨后膿毒癥、缺血/再灌注、胰腺炎、炎性腸病、關節炎、心肌梗死、T/HS等動物模型都有類似的發現[8]。越來越多的證據支持，體內存在迷走神經傳出纖維完成的膽堿能抗炎通路，從而對機體的炎癥狀態能夠做出迅速而有效的反應。

考慮到神經信號的傳導速度、中樞對傳入信息與全身狀態進行整合的特點，抗炎反射可能在機體的免疫平衡中處于核心地位[8]。通常認為，腦的室周器官(circumventricular organ，CVO)血腦屏障比較薄弱，全身炎癥狀態下外周血中的細胞因子和(或)內毒素可被此部位的特殊神經元發現，并將神經信號投射到腦干的自主運動神經元。但局部炎癥，或血液細胞因子濃度很低時，不足以通過CVO引起神經元的活化時，細胞因子等或可通過迷走神經傳入纖維將炎癥信號通知中樞[9]。Goehler等[10]研究證實，雄性CF1小鼠腸道局部感染，可使血漿促炎性細胞因子出現之前，就出現雙側迷走神經節感覺神經元、腦干孤束核以及主要的內臟感覺通路神經元的c-Fos表達(活化的標志)增加。Cailotto等[11]在腸道手術操作誘發的局部炎癥模型上發現通過迷走神經傳入纖維引起孤束核神經元活化的證據，并且迷走神經背核運動神經元發出的傳出纖維投射到腸道炎癥局部的42%活化。這些研究表明機體中樞神經存在感知外周炎癥的硬件連接，通過感知機體的炎癥狀態隨時做出迅速調整，維持機體的穩態。但是，抗炎反射的傳出通路有哪些，誰是效應器，我們都不清楚。

迷走神經是混合神經，為第10對腦神經。通常認為，其一般內臟運動纖維起于延髓的疑核和迷走神經背核，發出副交感節前神經纖維，在臟器內或附近的副交感神經節內換元，發出神經纖維分布于腹腔臟器。脾是膿毒血癥發病過程中TNF、HMGB1等炎性細胞因子的主要產生器官，被認為是抗炎反射的主要效應器官。體外研究顯示，膽堿能神經遞質通過α7 nAChR受體抑制巨噬細胞炎性介質的釋放，而脾臟與免疫細胞密切接觸的是腎上腺素能神經末梢。Rosas-Ballina等[12]在脾臟鑒定出一種分布在腎上腺素能神經末端的產乙酰膽堿記憶性T細胞，刺激迷走神經引起脾臟內去甲腎上腺素的釋放使這種記憶性T細胞產生大量的乙酰膽堿，通過α7 nAChR受體與周圍的巨噬細胞發生相互作用，壓制炎癥的過度放大造成的自我損傷。腸是膿毒癥、失血性休克、燒傷等危重狀態發病過程的關鍵器官，腸壁存在大量巨噬細胞、T細胞、DC細胞等免疫細胞。有研究也發現，脾切除后，刺激迷走神經引起的抗炎效應仍然存在[13]。這些結果提示，腸可能是抗炎反射的另外一個重要效應器官。和脾類似，迷走神經可能也不直接對腸內的免疫細胞進行調控。通過順行示蹤技術發現，迷走神經末梢可以直接和腸神經系統的節后神經元發生突觸聯系。腸壁內腸神經系統在黏膜下層和肌層組成致密的神經網絡，并與免疫細胞密切接觸?；蚩赏茰y迷走神經信號被腸神經系統放大，乙酰膽堿迅速增加，進而調節機體的免疫狀態。但是，迄今為止相關證據還很缺乏。

總是，機體通過抗炎反射感知機體的免疫狀態，通過迷走神經的膽堿能抗炎通路做出調整。對迷走神經的膽堿能抗炎通路進行調制可能為免疫失衡造成的機體過度炎性反應性疾病的防治提供新思路。

2 刺激迷走神經活化膽堿能抗炎通路與T/HS

目前，迷走神經刺激在臨床已經應用于重度抑郁、偏頭痛、藥物抵抗性癲癇的治療，并證明存在確實的療效[14,15]，其機制可能是由刺激迷走神經改變杏仁核或海馬體部位突觸后密集蛋白的成分，進而調節興奮性神經突觸的活性來實現的。近年來，刺激迷走神經通過活化膽堿能抗炎通路對T/HS的干預作用也越來越受到人們的重視，并開始探索臨床應用的可能。

2.1 電刺激迷走神經活化膽堿能抗炎通路 膽堿能抗炎通路的發現，也為T/HS的防治提供了新視野。Levy等[13]發現迷走神經刺激可使T/HS導致的腸道破壞、肺損傷以及嗜中性粒細胞扣押、呼吸爆發幾乎恢復到正常水平。Wu等[16]報道，迷走神經刺激可顯著減輕T/HS大鼠腸上皮細胞多糖包被層(epithelial glycocalyx)破壞和腸黏膜屏障的高通透狀態、腸和肺的損傷以及促炎性細胞因子的水平；而這種效應可被α7 nAChR 特異性拮抗劑甲基牛扁亭(Methyllycaconitine)顯著逆轉。Yagi等[17]的研究顯示，迷走神經刺激可顯著提高T/HS大鼠腸血流量和門靜脈血中去甲腎上腺素的水平。但是，不同于膿毒血癥動物模型的發現，電刺激迷走神經對T/HS器官的保護作用在施行脾切除術后仍然有效。同時發現，T/HS大鼠腸淋巴液回輸可引起正常動物出現急性肺損傷、嗜中性粒細胞呼吸爆發、紅細胞變形能力下降；迷走神經刺激休克腸淋巴液回輸未出現肺損傷，也未見白細胞和紅細胞的功能改變。這些結果提示，迷走神經刺激可阻止T/HS腸道損傷，降低腸淋巴液的損傷作用，對肺等器官提供保護。Reys等[18]研究表明迷走神經刺激可阻止T/HS引起的腸組織學損傷、通透性增加和緊密連接蛋白的移位，保持腸屏障功能的完整；以及減輕肺間質增厚、炎細胞浸潤、肺泡出血和透明膜形成等急性損傷性改變。手術離斷胃食管交界處迷走神經與腸神經的連接，但保留入肺的神經纖維，迷走神經刺激對T/HS后腸和肺的保護作用都消失了。因此提出，迷走神經刺激對T/HS器官的保護作用是通過“神經-腸-肺”軸機制實現的[18]。迷走神經刺激對T/HS器官的保護作用是通過維持腸屏障的完整性，減少腸源性的損傷因子移位入血造成的炎癥風暴，進而對肺等器官提供保護。越來越多的證據顯示，一直被忽視的腸淋巴液正是迷走神經刺激與腸外器官保護作用的中介環節[13]。但是，迷走神經刺激如何改變或者調制休克腸淋巴液的活性成分，以及是何活性成分引起了遠隔部位的器官損傷或者功能保護，仍然有待進一步探討。大量的學者從炎性介質、病原成分、蛋白質組以及脂質組學的改變進行了深入探索。最近的研究開始關注于免疫細胞譜系的改變和外泌體的作用。

腸道CD103+樹突狀細胞可以遷移入淋巴結，對T細胞的適應性免疫進行調節。T細胞在不同的微環境中可分化為輔助性T細胞(T-helper，Th)1、Th2、Th17以及調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)。Th17細胞定居于腸黏膜屏障之下，通過產生IL-17、IL-22等促炎性細胞因子，可消滅入侵到上皮層下的致病微生物。Treg細胞是一種具有免疫抑制作用的T細胞亞群，可特異性表達轉錄因子Foxp3，也主要定居在腸黏膜內，可限制效應性T細胞的過度活化，從而防止免疫反應時的自我損傷。Morishita等[19,20]研究發現，T/HS后腸淋巴液和腸系膜淋巴結中CD103+樹突狀細胞顯著下降，腸系膜淋巴結內CD4+Foxp3+細胞顯著減少、而CD4+IL-17+細胞顯著增加，并且同一個淋巴結內Treg與Th17細胞比值迅速降低；迷走神經刺激可增加休克腸淋巴液內CD103+樹突狀細胞數量，恢復腸系膜淋巴結內Treg細胞水平，穩定Treg與Th17細胞間的平衡。這些結果提示迷走神經刺激可通過腸道CD103+樹突狀細胞來調節Treg與Th17之間的平衡，重新設定T/HS后免疫過程的損傷與耐受，從而抑制過度失衡的炎癥風暴。

外泌體(Exosome)是指直徑在30～150 nm細胞外囊泡，其主要來源于細胞內的多囊泡體，經多囊泡體外膜與細胞膜融合后釋放到胞外基質中。多種細胞在正常及病理狀態下均可分泌，進而發揮多樣性的生物學作用。血液、尿液、腦脊液、腹水和淋巴液中均可分離得到。外泌體內裝載有包括蛋白、脂質、mRNA和miRNA在內的各種成分，所有這些成分都可能具有生物活性并能夠調節包括炎癥反應和氧化應激在內的各種生命過程[12]。外泌體可以通過參與炎癥過程從而在癌癥、糖尿病、肥胖、類風濕性關節炎、神經退行性疾病等病理過程中發揮重要的作用。研究表明，免疫細胞可以攝取其他細胞分泌的外泌體并觸發炎癥反應，例如急性結腸炎小鼠的血清外泌體可以激活巨噬細胞，上調其MAPK信號通路并釋放TNF-α[22]，此外，中性粒細胞、DC細胞等也可以被外泌體刺激參與炎癥反應[12]。Kojima等[24]報道，與休克前比較，SD大鼠休克期腸淋巴液內外泌體的含量上升2倍，而復蘇期減少了4倍。然而，與淋巴液上清相比，復蘇期分離的外泌體的生物活性明顯增加，可導致單核細胞NF-κB活化增加8倍；而且，復蘇期收獲的外泌體處理后的巨噬細胞產TNF-α能力顯著增加。在外泌體內容物中，多種成分可參與刺激受體細胞發生炎癥反應。例如在癌癥、細菌感染等疾病的外泌體中，HSP70蛋白水平顯著升高，并能通過激活免疫細胞的NF-κB通路、釋放NF-α、上調IFN-γ 和IL-13表達從而引起炎癥反應[25]。在肺癌中，腫瘤分泌的外泌體miR-21和mi-R29a可以與免疫細胞中Toll樣受體結合來觸發炎癥反應[26]。因此，外泌體內容物變化在多種疾病中炎癥的發生中發揮重要作用。Williams等[27]蛋白質組學的分析表明，T/HS腸淋巴液外泌體蛋白表達譜表現為富集于細胞信號、細胞存活與死亡和炎性反應等信號通路的特征；迷走神經刺激顯著抑制了T/HS誘導的淋巴液外泌體蛋白表達向炎癥表型轉化的改變，甚至接近于休克前的狀態。體外實驗證實，休克淋巴液外泌體顯著增加單核細胞NF-κB的表達；而迷走神經刺激后收集的休克淋巴液外泌體對單核細胞NF-κB的表達幾乎與休克前的外泌體無差別。這些數據表明，大鼠T/HS后外泌體不但發生含量的調整，更存在裝載內容物的變化，這種變化可能是休克淋巴液造成遠隔部位器官功能障礙或損傷的重要原因，而迷走神經刺激可顯著逆轉這種損傷性改變。此外，迷走神經刺激是否也可以調制外泌體內脂質以及mRNA和miRNA在內的其他成分參與休克的器官保護作用，有待進一步證實。

電刺激迷走神經對T/HS的保護機制可能是通過增加腸道CD103+樹突狀細胞數量來調節Treg與Th17之間的平衡，抑制T/HS后免疫細胞過度活化引起的炎癥風暴，進而保護腸道，降低T/HS腸淋巴液的損傷性活性，減輕肺、心、腎等遠隔器官的損傷[28]。但是，迷走神經刺激調制休克腸淋巴液的細胞和分子機制，以及迷走神經刺激保護休克器官免受損傷的具體效應分子都有待進一步的確定。這一系列問題的解決將為臨床相關疾病的治療提供新思路。

2.2 藥物刺激迷走神經活化膽堿能抗炎通路 盡管直接電刺激迷走神經在臨床已有應用，但作為一種侵入性操作給予T/HS患者將有很多限制。Guarini等[29]發現，促腎上腺皮質激素(adrenocorticotropin，ACTH)靜脈注射可引起T/HS大鼠迷走神經傳出纖維活性在幾分鐘內迅速增加，10～15 min達到高峰，這一效應可以穩定持續>30 min，而ACTH不會引起正常動物出現類似效應。同時發現，ACTH可以使T/HS大鼠生存時間顯著延長，血漿NF-κB轉錄活性、TNF-α含量恢復到基線水平。進一步的機制探討中發現，ACTH的抗休克作用可被雙側迷走神經離斷、選擇性黑色素皮質激素MC4受體阻斷劑HS014、硫酸阿托品所阻斷；而不能通過血腦屏障的溴化甲基阿托品無此作用。因此推測ACTH可通過中樞機制引起迷走神經傳出活性增強，活化膽堿能抗炎通路，抑制炎癥瀑布，進而對T/HS大鼠提供保護。Morishita等[30]報道，T/HS大鼠靜脈給予鳥嘌呤衍生化合物CPSI-121后，迷走神經放電顯著加強，并可持續>30 min；腸道組織學損傷幾乎恢復到正常水平；腸淋巴液對嗜中性粒細胞的觸發效應迅速下降；肺組織損傷積分回落、水腫減輕。同時，也發現CPSI-121對炎癥腸道的保護作用在迷走神經傳出纖維腸支手術離斷后消失[31]。隨后Langness等[32]證實CPSI-121治療可顯著減輕休克腸淋巴液回輸引起的正常小鼠全身性低血壓狀態和以信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，Stat3)高磷酸化為特征的單核細胞活化；并且，以肺泡出血、氣道水腫為特征的肺組織形態學損傷，肺組織高通透性和炎細胞浸潤也顯著緩解。這些結果提示，CPSI-121可以通過增強迷走神經活性保護腸道，減少休克腸淋巴液的損傷活性，對肺等全身臟器提供保護作用。此外，與CPSI-121具有相似結構基礎的其他鳥嘌呤衍生化合物CPSI-2364[33]、CNI-1493[34]是否也有相似的迷走神經活化的作用，還未見報道。

2.3 腸內高脂營養刺激迷走神經活化膽堿能抗炎通路 腸道內營養物質與自主神經的相互作用在機體的消化、免疫和代謝功能調節中具有非常重要的作用。越來越多的研究顯示，高脂腸內營養可活化迷走神經，通過膽堿能抗炎通路抑制機體的炎性反應[35-39]。Lin等[39]觀察發現，腸內高脂營養可顯著減輕休克腸促炎性細胞因子、運動能力以及腸黏膜屏障功能損壞的程度。Luyer等[36]發現，T/HS前45 min給大鼠腸內高脂營養(52%脂肪、41%碳水化合物和7%蛋白)可使腸屏障通透性、遠隔器官細菌移位、血漿內毒素、TNF-α和IL-6水平顯著降低；而這些效應可被辣椒素迷走神經傳入纖維毀損、迷走神經離斷術所拮抗。通常，不同的腸內營養成分可通過不同的機制活化自主神經，高脂飲食可引起腸促胰酶肽(cholecystokinin，CCK)分泌，目前認為CCK可能是腸內高脂營養活化迷走神經的關鍵環節。相關實驗都發現，CCK-1和CCK-2受體阻斷劑均可對抗腸內高脂營養對T/HS大鼠腸道完整性和全身炎性反應的保護效應[36,37]。但Lubbers等[37]的實驗進一步證實，CCK-1受體拮抗劑devazepide的拮抗效應顯著強于CCK-2受體拮抗劑L365,260；并且，外周使用不能通過血-腦屏障的CCK-1受體拮抗劑A70104能夠完全廢除腸內高脂營養對T/HS大鼠腸道完整性和全身炎性反應的保護效應；給予外源性CCK-1受體激動劑PEG-CCK9能模擬腸內高脂營養降低T/HS大鼠腸通透性、細菌移位、TNF-α和IL-6水平的效應；而A70104可顯著抑制PEG-CCK9的對T/HS大鼠腸道或炎癥水平的保護效應。這些發現提示，腸內高脂營養引起腸道CCK釋放，通過外周CCK-1受體觸發迷走神經傳入纖維放電，進而活化膽堿能抗炎通路的腸道保護效應。隨后的研究發現，T/HS后早期和晚期治療性給予腸內高脂營養均可通過CCK受體依賴的方式抑制腸道局部炎癥、減輕腸道損傷、降低全身循環血中IFN-γ和IL-10水平以及細菌/內毒素移位[39]。這些結果提示，腸內高脂營養可能會成為一種通過活化膽堿能抗炎效應防治T/HS的優選方案。

總之，迷走神經刺激引起的抗炎反射在T/HS的發生發展過程發揮重要作用。T/HS的發展過程中，分布在腹腔臟器的迷走神經傳入纖維感受機體微環境的變化，將信號傳遞給腦，腦內中樞不同核團對信息進行整合后，通過迷走神經傳出纖維重新設定腸道免疫反應調定水平，即耐受和損傷的平衡機制，進而由腸淋巴液將損傷和耐受的效應分子傳遞給肺、腎、肝、心等各個臟器。因此，以機體抗炎反射的各個環節為靶點，活化迷走神經啟動膽堿能抗炎通路，將從整體水平控制全身炎性反應的瀑布級聯效應，避免單個的拮抗因子對抗整個炎癥網絡的無效結局，將為T/HS的防治提供新思路。