黃酮類混合物的堿金屬加合離子電噴霧質譜研究1

張 娜，崔 朋，劉 偉

（1.黃山學院 化學化工學院；2.黃山學院 現代教育技術中心，安徽 黃山 245041）

在天然產物的研究中，應用質譜技術鑒定未知的活性物質具有特別重要的意義.然而，利用現有的分析技術和方法對這些化合物進行結構鑒定仍然是一個挑戰.這是由于天然產物中有較多異構體的存在，且有些物質具有高豐度的碎片離子峰，而分子離子峰的豐度較低、信息貧乏，從而導致未知化合物識別過程中具有不可避免的模糊性.

為了克服上述缺點，學者們做出了不同的探討.Hadavi Darya［1］以加合離子的形成作為研究10 種異構體分子結構的工具，結果表明飛行時間（TOF）對鈉和鋰加合物具有最高的分辨率，同時加合離子的形成有助于結構異構體甚至立體異構體在分離時產生不同的分子構象，因此評估加合物和不同構象結構是物質分離鑒定時很有價值的策略.Younes Valadbeigi［2］、Tamar Shamai Yamin［3］也利用質譜中伴隨的金屬離子加合物使結構解析更加可靠.趙凡智課題組［4］研究發現，在糖苷混合物中引入堿金屬離子后，混合物FAB 正離子譜中僅出現加合離子峰而難于找到碎片的加合離子峰，且由于兩種堿金屬離子Na+和Li+原子量之差為16，質譜圖中會出現兩個一組的多組強峰，且每組的兩峰質量差為16，其中低質量峰為［M+Li］+峰，高質量峰為［M+Na］+峰，以此可以判斷各成分的精確質量數，同時譜圖中出現的強峰組數就是糖苷混合物的成分數.周劍［5］、荀合［6］等人也得出了類似的結論.

在眾多的研究中，堿金屬離子主要采用Li，Na，K和Cs；基體為巰基尿酸共軛物［1］、胞嘧啶［2］、哌醋酯衍生物［3］、糖苷混合物［4］、疏螺旋體素［5］、丙烯醛脫氧鳥苷［7］、甜菜堿等生物樣品［8］、苯分子［9］、木質素［10］、聚己二酸丁二醇酯［11］、聚乙二醇［12］等；廣泛采用的離子源為FAB 及ESI 離子源［4-14］；以ESI 為離子源，黃酮和黃酮苷為基體，采用UPLC-QTOF-MS技術研究黃酮類堿金屬加合物則未見報道.

本文利用UPLC-QTOF-MS 技術，采用ESI 離子源，在正離子模式下采集數據，研究了7種黃酮類混合物（基體B）與堿金屬離子混合物M+（M=Li、Na 和K）的加合質譜，探討了基體B 與M+在不同碰撞能、不同濃度、不同加入方式下堿金屬加合離子的形成以及不同加合離子的相對豐度，以期為天然產物中未知物質的分離鑒定提供理論依據.

1 試劑與儀器

主要試劑有表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、芹菜素-7-o-β-D-吡喃葡萄糖苷、異鼠李素、煙花苷、芒果苷、野漆樹苷、甲醇、乙腈、無水乙醇，均為HPLC或更高級別；氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀為優級純.

主要儀器有超高效液相串聯飛行時間質譜聯用儀（waters）、超純水機（Milli-Q）等.

2 實驗條件

2.1 UPLC色譜條件

CORTECS UPLC C18 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）；純水A-乙腈B 流動相；梯度洗脫程序為0～1 min（90%A，10%B），1～15 min（90%A～10%A，10%B～90% B），15～17 min（10% A～70% A，90% B～30% B），17～17.5 min（70% A～90% A，30% B～10% B），17.5～20 min（90% A，10% B）；柱溫為40.0℃；流速0.300 mL/min；進樣量為1 μL.

2.2 Q-TOF/MS質譜條件

使用電噴霧離子源進行正離子掃描（ESI+）；掃描范圍m/z 100～1500；掃描時間0～20 min；錐孔電壓40 V；毛細管電壓3 kV；使用900 L/h 氮氣為除溶劑氣體；除溶劑溫度為500 ℃；碰撞能量分別采用6 eV 和10～20 eV.

2.3 實驗步驟

黃酮類基體B 混標與單標均為10μg/mL 甲醇溶液；堿金屬離子M+混合溶液為0.1 mol/L 水溶液，使用時逐級稀釋.

不同碰撞能：6 eV（模式一，低能量）和10～20 eV（模式二，高能量）；

不同濃度M+：濃度分別為0、5×10-3mol/L、5×10-2mol/L；

M+不同加入方式：流動相中加入M+直接掃描；基體B中加入M+，放置1 h后掃描.

3 實驗結果與討論

3.1 總離子流圖

圖1 總離子流圖（ESI+，碰撞能10～20eV，M+=5×10-3mol/L）

由圖1可見7種化合物實現分離，根據質譜圖中的準分子離子峰，可確定峰1～7 分別為表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素、芒果苷、芹菜素-7-o-β-D-吡喃葡萄糖苷、野漆樹苷、煙花苷、異鼠李素.

3.2 不同碰撞能時化合物的質譜圖

以野漆樹苷為例（精確質量數為578.1626），對比模式一和模式二（碰撞能量分別為6 eV 和10～20 eV）下的質譜圖，觀察不同堿金屬加合離子的豐度.由圖2可見，不同碰撞能下，m/z 579［M+H］+豐度均為最大，m/z 585［M+Li］+豐度極小，碰撞能增大時，m/z 601［M+Na］+、m/z 617［M+K］+豐度明顯升高，更適合于觀察堿金屬加合物.同時，各加合物［B+M］+成組出現，質量數之差為16，可直接確定待測物的精確質量數.下文以高能量時質譜圖為例，進行豐度對比.

圖2 不同碰撞能下野漆樹苷的質譜圖

3.3 不同濃度M+時化合物的質譜圖

以野漆樹苷為例，對比不同濃度M+時化合物的質譜圖（M+=0、5×10-3mol/L、5×10-2mol/L），觀察不同堿金屬加合離子的豐度（見圖3），結果顯示隨著M+離子濃度的增加，m/z 601［M+Na］+、m/z 617［M+K］+豐度都有所升高，顯示加合物的豐度與M+濃度有關.同時高碰撞能下m/z 579［M+H］+、m/z 585［M+Li］+豐度極小，推測［B+M］+的豐度不僅與底物的結構和金屬離子濃度有關，還與金屬離子的直徑大小有關.同時，加合物［B+M］+仍然成組出現.

圖3 不同濃度M+時野漆樹苷的質譜圖

3.4 不同加入方式時的質譜圖

以野漆樹苷為例，對比不同加入方式時化合物的質譜圖（加入基體B中放置1h、加入流動相），觀察不同堿金屬加合離子的豐度（見圖4），結果顯示直接加入流動相時，加合物的豐度相對較高，加合物［B+M］+也成組出現.

圖4 不同加入方式時野漆樹苷的質譜圖

3.5 不同實驗條件下，堿金屬加合離子的豐度對比

以相同的方法研究了除野漆樹苷外的其他6種黃酮類化合物，探討了不同碰撞能（6 eV、10～20 eV）；不同濃度M+（0、5×10-3mol/L、5×10-2mol/L）；M+不同加入方式（加入流動相中、加入基體B 中并放置1h）條件下，加合物［B+M］+的豐度變化，結果顯示，表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、芹菜素-7-o-β-D-吡喃葡萄糖苷、異鼠李素、煙花苷、芒果苷6 種黃酮類化合物與野漆樹苷具有相同的規律，不同條件下各加合物［B+M］+的豐度見表1-3.

由表1 可見，隨著碰撞能的增加，［M+H］+的相對強度通常會減弱，加合物［B+M］+的相對強度有所增強；異鼠李素在不同碰撞能條件下，［M+H］+的相對豐度均為最高，從結構上看，與文中其他6種黃酮類物質相比，其結構中含有的羥基最少，推測是由于羥基最少且不含糖苷，因此相對來說難以形成［B+M］+加合物.

表1 不同碰撞能時，加合物［B+M］+的相對強度（M+=5×10-2mol/L）

（續表1）

由表2 可見，隨著M+濃度的增加，［M+Li］+、［M+K］+的相對強度逐漸增強；［M+H］+、［M+Na］+的相對強度則無此規律，這或許是由于受環境或流動相中H+、Na+影響的緣故.

表2 不同濃度M+時，加合物［B+M］+的相對強度（M+=0、5×10-3mol/L、5×10-2mol/L，10～20eV）

由表3 可見，通常情況下，將M+加入流動相中，可以獲得更高的［B+M］+豐度.同時可以看出，低碰撞能和低的M+濃度下，［M+H］+相對豐度通常較高，這對加合物［B+M］+的研究是不利的，提示在進行［B+M］+研究時應采用高碰撞能和高的M+濃度.

表3 不同加入方式時，加合物［B+M］+的相對強度（加入基體B中放置1h、加入流動相中，M+=5×10-3mol/L，6eV）

4 結論

如上所述，在基體中加入適量的堿金屬離子形成加合離子可以作為確定未知物精確質量數和結構鑒定的常用方法.研究結果顯示：在流動相中加入高濃度的M+離子，采用高的碰撞能掃描模式，可以在質譜中看到更多的、豐度更高的堿金屬加合離子.由于堿金屬加合離子之間的差值均為16，同一物質能觀察到幾對加合離子峰，故可以較容易的判斷出準分子離子，從而為復雜混合物的分析鑒定提供參考.需要注意的是，不同化合物加合離子的形成具有選擇性，對Li+、Na+和K+表現出不同的加合能力，這仍需要進行深入的研究.