國內外柳樹植原體病害研究現狀

賴剛剛，李 豐，黨金歡，冶子耕，張 萍，朱天生

（塔里木大學植物科學學院/南疆農業有害生物綜合治理兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

0 前言

柳樹（Willow），楊柳科柳屬，雙子葉落葉喬木，對環境的適應性廣，喜光，喜濕，耐寒。其品種繁多，全球約520余種，中國有250余種且分布在全國各地。作為一種重要的觀賞性樹種，柳樹在我國的栽培歷史已有2000多年。柳樹生命力強，栽培方法簡單且易繁殖，是重要的綠化用樹，許多國家將其作為城市、小區、園林和道路等綠化樹種，在觀賞、工藝與環境方面都有極大價值，在部分干旱地區維持生態平衡有很大優勢，對于區域經濟的發展也具有重要作用。

植原體（Phytoplasma）過去稱作類菌原體（Myco?plasma-like Organism，MLO）是一類專性寄生菌，屬原核生物界（Prokaryota）柔膜菌綱（Mollicutes）[1]。無細胞壁，由葉蟬和飛虱等刺吸式口器昆蟲傳播，也可通過菟絲子和嫁接進行傳播。寄生于植物韌皮部和昆蟲的唾腺細胞。植原體病害最早記載是在1000 多年前，在我國宋朝的牡丹花上發現，由于牡丹花發病后形狀奇特而被人們認為是花之典范[2]。我國明崇禎末（約公元1640 年前后）《沈氏農書·運田之法》中也有記載桑樹矮縮病[3]?？茖W界最早記載是在200 年前日本的桑樹上發現桑樹矮縮病，1967年日本植物病理學家土居養二（Doi）利用電子顯微鏡在表現叢枝癥狀的桑樹等植物韌皮部篩管細胞中發現類似“支原體”的微生物，后命名為類菌原體[4]，引起植物病理學界廣泛關注，極大推動植原體的研究。1992 年第9 屆國際支原體大會上，比較支原體國際研究項目植原體工作組（IRPCM）首次提議用“植原體”（Phytoplasma）這個名字來代替“類菌原體”（Mycoplasma-like organisms）[5，6]。1994年第 10屆國際菌原體組織會議上類菌原體正式被更名為植原體[3]。

1 國內外植原體研究現狀及分析

1.1 植原體生物學特性

植原體具有復雜的細胞結構，由厚度約為10nm的2層蛋白質膜和中間一層脂肪膜組成的單位膜包裹[7]。其直徑200～800nm，形態各異，有球形、橢圓形、棒形、細絲狀[8，9]、不規則形等，其形態隨所處環境的不同而發生變化[4]。植原體主要分布在被害植物韌皮部的篩管、伴胞、韌皮薄壁細胞及韌皮纖維中；在介體昆蟲中主要分布于唾液腺和脂肪體組織中[10]，可侵染昆蟲的卵，還可在昆蟲體內進行繁殖。目前為止，植原體尚不能像其他細菌一樣人工體外培養。Nicoletta Contaldo[11]等人在2012 年報道了對植原體的純培養方法，但由于該方法操作繁瑣、成本代價高未被廣泛應用到植原體研究中。

植物被植原體侵染后，會在不同的部位引起一系列相應的癥狀變化，如芽、莖、葉、花等不同部位會產生不同的癥狀，使植物的代謝發生紊亂。感病植物所表現出來的癥狀也會隨植物所處生長時期不同而發生變化，某些抗病植物表現出來的癥狀也會不明顯。國際上已見報道的植物被植原體危害后表現出來的癥狀主要有叢枝、黃化、花變葉、矮化、簇生、小葉、扁莖等。

1.2 植原體分類

由于植原體種類繁多，侵染不同的寄主植物后寄主表現出相同或相似癥狀，幾種植原體復合作用后引起的植物病害很難鑒定，加之植原體引起的癥狀與病毒引起的極為相似，因此植原體的研究面臨著許多困難與挑戰。早期研究人員主要根據寄主植物被植原體危害后，所表現出的癥狀及介體昆蟲的?；赃@兩類特征對植原體進行分類，但這種分類方法并不全面和系統。目前植原體的分類主要還是依據其16S rRNA、rp（核糖體蛋白）、secY（分泌蛋白）等保守基因序列和基因組差異，及對傳播介體、天然植物寄主和限制性酶切片段多態性分析。根據植原體16S rRNA基因序列RFLP分析圖譜的相似系數，可將部分植原體分為不同的組及亞組[12]。2007年Wei wei等[13]用計算機模擬和RFLP分析鑒定了10 個新的植原體組。截止2019 年6 月植原體已鑒定劃分為52個暫定種、36個組和100多個亞組[3]；被完整測序的植原體基因組已有6 種，植原體基因組草圖測序成功的也有19種[7]。植原體基因組中有兩個rRNA操縱子，而這兩個rRNA操縱子基因序列存在同源異質性，因此，在植原體16S rRNA 基因克隆測序中會出現序列不一致的結果，所以在分類鑒定中盡量選擇高度保真的DNA 聚合酶進行PCR 擴增，并多挑一些單克隆抗體進行測序，以保證植原體的16S rRNA 基因序列的真實性。雖然16S rRNA基因序列較為保守，可以較好地對植原體進行種、組和亞組的區分，但難以對種內不同株系進行區分。對植原體種內進一步分類，應更多地克隆測序種間保守、種內變異較大的基因，如tuf（與蛋白質合成有關的延伸因子EF-Tu）基因、rp基因、secY基因、膜蛋白基因等，并對以上基因進行序列一致性比對和分析[3]。tuf基因除了用于確認植原體菌株的分類地位之外，還可以追蹤寄主植物和昆蟲載體中的植原體菌株的擴散[14]。植原體的分類鑒定，還應注重植原體的寄主范圍、特定植物寄主癥狀及不同的傳播昆蟲介體等植原體生物學特性的研究。

1.3 植原體檢測

在過去的幾十年里，由于沒有獲得植原體的純化培養基，所以對植原體的檢測，通常是通過寄主植物所表現出來的癥狀選擇將感病植物制成超薄切片，進行觀察判斷；因植原體對四環素及其衍生物類的藥物敏感，給感病植物注射四環素，若癥狀消失，則證明感染植原體[4]；或根據寄主植物的種類、表現出來的癥狀、傳播介體等也可對是否植原體進行判斷。但由于寄主植物間差異、種類差異、抗性差異、環境因素等，對植原體進行鑒定時，耗時耗力且鑒定結果不一。隨著科技的發展及電子計算機水平的進步，目前，應用于植原體的檢測方法主要有電子顯微鏡法、組織化學法、血清學方法、PCR法和核酸雜交法等。

1.3.1 電子顯微鏡法

植原體無細胞壁，且形態大小容易受環境的影響，在電鏡下觀察到的形態有球形、桿狀、細絲狀、不規則形等，大小在200～800nm 不等。該方法可直接觀察到植物組織結構中的植原體，具有較高的可行性，缺點是需要復雜的儀器設備，耗時耗力，費用高，難以普及。

1.3.2 血清學方法

1985年，Lin等[15]首次報道成功制備翠菊黃化病植原體的單克隆抗體。1988年，Chen等[16]也成功制備玉米叢矮病植原體的單克隆抗體。林木蘭等[17]成功制備泡桐叢枝病植原體的單克隆抗體，并進行泡桐叢枝病的檢測。隨后，科研工作者又相繼成功制備了多種植原體的單克隆抗體并開展病害診斷。目前，主要的血清學方法有：瓊脂雙擴散、酶聯免疫吸附測定、點免疫測定、熒光免疫及免疫電鏡技術等。

1.3.3 核酸雜交技術

核酸雜交技術是利用超速離心技術等獲得待研究植原體的DNA，然后將其酶切，回收片段DNA，將該片段標記制成DNA探針，通過雜交該探針來檢測植原體。特別是在檢測木本植物中的植原體時，該方法具有快速靈敏的特點，但由于某些木本植物中植原體濃度低，也使該技術的使用受到一定限制。目前，主要的核酸檢測技術有：點印跡雜交技術、原位雜交技術和Southern 雜交技術。

1.3.4 組織化學法

組織化學法是利用熒光染料與光學顯微鏡對植原體進行檢測。主要有DAPI 熒光顯微技術、迪納氏染色、苯胺藍染色等方法。DAPI對真原核細胞的核具有極高的靈敏性，是檢測植原體的高效熒光染料。組織化學法是一種間接的檢測手段，在被害植物植原體含量較低、植物組織中胼胝質含量積累、含有大量酚類物質及DNA 干擾物時，可能會出現假陽性結果，應用時會受到限制，可作為輔助手段。

1.3.5 PCR技術

目前用于植原體檢測的有巢式PCR（Nested PCR）、免疫捕獲PCR（Immuno capture PCR）、競爭PCR（COP-PCR）、循環PCR（Rcycled-PCR）和實時熒光PCR 技術（Real-time PCR）等。巢式PCR 是使用兩對通用引物對植原體進行兩輪擴增，從而提高檢測的靈敏度；免疫捕獲PCR是采用單克隆抗體或多克隆抗體選擇性捕捉植原體DNA，再以捕捉的植原體DNA 為模板，用通用或特異引物進行PCR 擴增，從而避免復雜的模板DNA 抽提過程，同時還提高植原體的檢測靈敏度[14]。

實時熒光定量PCR 技術是指在常規PCR 反應體系中加入熒光標記探針，該探針與PCR產物雜交時，能檢測到熒光信號，因而熒光信號反映了PCR擴增產物的數量[18]。該技術比常規PCR具有更高的靈敏度、且能快捷簡便地定量檢測植物病原，還具有核酸雜交和光譜技術的高精確性和高特異性，在植原體檢測工作中具有廣闊的應用前景。我國廖曉蘭等[19]首次將實時熒光PCR 法用于植原體病害的檢測，設計并合成椰子致死黃化、蘋果叢生、榆樹黃化3組植原體特異性熒光探針和植原體廣譜熒光探針，成功對植原體進行分類鑒定[20]。

1.3.6 LAMP（環介導等溫擴增技術）檢測

近年來，LAMP 檢測已被用于檢測寄主組織中的植原體，是一種全新的核酸擴增方法，該方法具有檢測成本低、速度快、操作簡易、特異性強、靈敏度高和可視化等優點，非常適合在基層推廣和病害現場的快速檢測。2015年韓劍等[21]運用LAMP技術建立棗瘋病植原體可視化檢測技術；2017年王圣潔等[18，22]建立寡核苷酸管芯片技術檢測和鑒別植原體技術體系，并利用LAMP 技術，以tuf基因為靶標擴增5 種16SrⅠ組植原體。此外，還建立了一些替代診斷方法，例如異源雙鏈體移動性測定[23]、單鏈構象多態性[24]、T-RFLP[25]等。

1.4 植原體病害綜合治理

植原體病害以預防為主。加強檢疫與預防，利用寄主植物抗性、有效控制傳播介體、切斷傳播途徑并結合化學防治等方法來綜合治理。

1.4.1 農業防治

植原體病害的農業防治方法主要是消除侵染源，從源頭阻斷植原體的傳播，如加強植物檢疫，保證苗木及嫁接穗無病害；加強病蟲害防治，阻斷葉蟬、飛虱等刺吸式昆蟲的傳播，控制中間寄主。陽小勇等[26]提出測土配方防治方法，即測定土壤中各種養分的含量，缺哪種元素就進行相對應的補充，保持作物健壯，從而提高作物抗病力。

1.4.2 物理防治

主要是通過熱、冷處理的方法來脫除植物體內的植原體。高溫對植原體的生長發育有直接的影響。低溫也能有效脫除植物體內的植原體病原。

1.4.3 化學防治

植原體對四環素及其衍生物類藥劑較為敏感。2015年馮文全等[27]以呼和浩特市柳樹叢枝病為研究對象，用利福平、利福平+苯氧威和苯氧威等不同藥劑做藥效試驗，結果表明3%的苯氧威對柳樹叢枝的抑制效果較為明顯。李巖峰等[28]報道四環素和阿維菌素兩種藥劑復配后通過噴灑和樹木輸液的方法，能夠有效防治植原體病害，還有助于殺死傳播介體昆蟲。也有人提出植物激素治療，但需要進一步研究和實驗數據支持[29]。

1.4.4 生物防治

在植物葉面噴施生物農藥，如枯草芽孢桿菌，阿泰靈等可增加植物的抗性，有效緩解植原體對作物的危害。

1.4.5 選育抗病良種

劉曉光等[30]以棗瘋病植株培養苗中出現的疑似抗病株為材料，觀察并提取DNA進行測定。在篩選的10株疑似抗病變異株中，經過植原體檢測后發現其中3 株內仍攜帶有少量植原體，進一步對這些疑似變異株進行DNA 水平的AFLP 分析，最終篩選出1株抗病株。

2 柳樹植原體病害研究現狀

2.1 為害癥狀

國內外已見報道的柳樹植原體病害主要有柳樹叢枝（Willow witches-broom）、柳樹黃化（Willow yellows）、柳樹增生（Willow proliferation）和柳樹花變葉（Willow phyllody）等（圖1），并被劃分到16SrⅠ組、16SrⅥ組、16SrⅨ組和16SrⅫ幾個不同亞組。柳樹感染植原體后，由于植原體寄生于寄主韌皮部組織中，會隨著植物水分和養分運輸到樹體頂端，因此柳樹植原體病害的癥狀多發生于樹體新抽枝條或頂端；除表現出以上典型癥狀之外，還出現小葉、球狀結構、非季節性落葉、枝條干枯等癥狀，隨著植原體含量不斷積累，樹體水分和養分供應不足，最終造成樹木頂枯甚至死亡；另外，在部分干旱地區6—7月份溫度高、蒸發快，當樹體感染植原體后，養分和水分會供應不足，使柳樹提前進入落葉期，樹葉發黃、脫落，造成非季節性落葉現象。

2.2 國內研究現狀

我國最早報道該病害是在1992 年王純利[31]等發現新疆白柳叢枝病，當時部分研究者認為是由螨類危害引起的，但通過電子顯微鏡在柳樹韌皮部觀察到啞鈴狀無細胞壁顆粒，證明該叢枝病是由類菌原體引起；上世紀90年代植原體病害全疆各地均有發生，但由于當時技術條件不足，未能從分子水平將其鑒定與分類。2005年朱天生等[32，33]調查南疆柳樹花變葉植原體病害，巴州地區發病率約10%，克州地區發病率為6%，喀什地區、圖木舒克市、阿克蘇地區、阿拉爾市和和田地區發病率分別為46%、51.3%、64.3%、51%和48%，2007年對來自新疆阿拉爾市的柳樹花變葉進行鑒定，通過16SrRNA和rp基因分析將其劃分到AY 植原體組的16SrI-B 亞組。2009 年魏婷等[34]在陜西發現柳樹黃化植原體，并將其劃分于16SrΙ-C亞組。2011年Ana Alfaro-Fernan?dez[35]等報道西班牙東部地區發生柳樹植原體病害，發病柳樹表現出小葉、黃化和球狀的癥狀，將其劃分到16SrⅫ組。2012年張磊[36]等發現內蒙古鄂爾多斯市柳樹表現出叢枝、黃化、小葉、增殖和球狀等異?，F象，對16SrDNA 進行RFLP 分析將其劃分到16SrⅥ-A亞組，這是我國首次將植原體分類到16SrⅥ-A 亞組。Mou[37]等在2014 年報道湖南省元謀縣發現柳樹植原體病害，柳樹表現出叢枝和花變葉等異常癥狀，通過對 16SrRNA 基因、tuf基因和rp基因進行分析，將其劃分至16SrΙ-B亞組。

2.3 國外研究現狀

國際上最早是1972 年Holmes[38]等在美國新罕布什爾州發現柳樹叢枝病，后來歐洲柳樹上也發現相似病害，研究者通過電子顯微鏡觀察到無細胞壁的形態多樣顆粒，證明該病害與美國發現的為同一類病害，由于當時科學技術水平有限，無法證明其為植原體病害。1978年Varma[39]在印度也報道了柳樹叢枝病害。1994 年 Abdul-Hameed Khadha 等[40]在加拿大首次發現柳樹叢枝植原體病害，通過擴增和分析16SrDNA基因發現其為三葉草增殖組成員，當時柳樹叢枝病在加拿大幾種柳樹上普遍發生，另外還有部分植原體屬于翠菊黃花組（16SrΙ 組）。2017年Maryam Ghayeb Zamharir[41]等在伊朗發現柳樹叢枝表現出的癥狀與我國新疆和內蒙報道的柳樹植原體引起的癥狀極其相似，經系統發育分析后認為該植原體屬于16SrⅫ組，與西班牙柳樹叢枝植原體為同一組。2018 年 Fatemeh Shahryari 等[42]又報道伊朗柳樹增殖，經過系統發育分析和RFLP分析，該植原體為16SrVI-A亞組成員。

3 結論與討論

自PCR技術出現以來，該技術對于植原體的檢測一直穩定有效，LAMP 檢測提高時效性。由于植原體不能體外培養，DNA 獲取含量少，操作時容易污染；PCR 檢測過程也容易出現假陽性結果，不能準確檢測植原體，需要通過測序獲得基因片段序列后才能確定，此過程代價較大，因此亟需開發有效快速的特異性檢測技術。

植原體病害在世界的分布范圍越來越廣，寄主范圍不斷擴大，家族成員也越來越豐富。近年來，印度和伊朗報道柳樹植原體病害較多。柳樹不像梨、杏和棗等一些經濟樹種能帶來直接經濟效益，因此，柳樹植原體病害尚未納入檢疫性病害，對該病害的傳播、流行和防治等方面研究并不多。而柳樹植原體病害存在潛在的巨大危害，不僅嚴重危害柳樹，造成柳樹幾年內干枯甚至死亡，導致嚴重的損失；另外植原體引起柳樹形成的叢枝、花變葉、增殖和球狀等癥狀，還會為部分農業害蟲提供良好的越冬場所，間接對農業生產形成嚴重威脅。目前，亟需提出科學有效的防治措施來控制柳樹植原體病害傳播與發生，以減少農林業生產損失。