李知宗,劉驚濤,陳恒玲,林顯光
(中南民族大學 生物醫學工程學院/腦認知國家民委重點實驗室/醫學信息分析及腫瘤診療湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430074)
近年來,多肽類藥物在各類疾病中得到了快速發展。為了更加準確地掌握藥物在體內的吸收、代謝規律,就需要對其藥代動力學進行研究。目前,對藥動學參數的研究大多采取HPLC、LC-MS,成本較高[1]。因此,本文利用熒光酶標儀,對肽類藥物藥動學參數的確立進行改良,為后續研究提供理論基礎。
雄性SD大鼠,SPF級,體重180~200 g,購買于湖北省疾病預防控制中心。飼養于12h光照/12h黑暗的環境中,自由攝食飲水。動物實驗與處理均遵照《中南民族大學實驗動物使用與福利指導手冊》。
實驗試劑如表1所示,主要儀器設備如表2所示。
表1 主要實驗試劑
表2 主要儀器設備
(1)0.9%的生理鹽水:稱取4.5 g 氯化鈉溶于500 mL超純水中,滅菌后分裝。
(2)20%的溶液:稱量8 g 溶于40 mL的生理鹽水中,備用。
(3)熒光標記肽COX52-69按每管2 mg分裝,避光環境下,每管溶于0.85 mL生理鹽水中,凍存于-20 ℃備用。
實驗前將大鼠斷糧12~16 h,飲水不限。將大鼠固定于實驗動物固定器中圖1(a),鼠尾暴露于籠外。用橡皮筋或縫合線捆扎鼠尾根部,置于40 ℃熱水中5~10 s,使鼠尾靜脈充盈腫脹,易于顯現靜脈。右手持針,盡量使進針處血管與針頭方向平行,針頭平行于鼠尾刺破表皮圖1(b),若可見回血,則左手捏住鼠尾,右手推拉注射器活塞,制造負壓,抽取1.5 mL血液[2]。取血結束,用脫脂棉球按壓針眼部位30 s,確定止血后放開大鼠。
將取得的血液置于4 ℃冰箱中靜置2 h后,利用低溫高速離心機(1000 r/4°,10 mins)進行離心,分離上層血清于新的EP管中,再用低速離心機(500 r/min)進行復離,得到上層血清300 μL。避光環境下,精確稱取0.7 mg熒光標記肽粉末,加入血清中,利用渦旋振蕩器混勻,作為陽性對照。將血清按照每孔50 μL加入96孔板,并將96孔板放入酶標儀的測量小室中。調整酶標儀的測量參數,激發波長488nm,發射波長521nm,測量時間100ms,激發帶寬12nm,并在測量前輕微震蕩板壁,使血清平鋪孔底。
圖1 大鼠尾靜脈取血
選取180~200 g 的SD大鼠,于實驗前12~16 h斷糧,并隨機分為實驗組與空白組。對所有大鼠進行尾靜脈取血。取血完成后,實驗組以2.5 mg/kg對大鼠腹腔注射熒光標記肽COX52-69,空白組以2.5 mg/kg對大鼠腹腔注射生理鹽水。注射完成后,以2 g/kg對兩組大鼠灌胃20%的溶液,并將此刻記為零時刻。于15、30、45、60、75、90、105、120 min分別取靜脈血。將所有血液樣本于低溫避光環境下靜置2 h,利用低溫離心機分離上層血清。將血清按照每孔50 μL加入96孔板,并將96孔板放入酶標儀的測量小室中。調整酶標儀的測量參數,激發波長488 nm,發射波長521 nm,測量時間100 ms,激發帶寬12 nm,并在測量前輕微震蕩板壁,使血清平鋪孔底[3]。將測得的熒光強度(RFU)按公式(1)轉化為血藥濃度。熒光標記肽COX52-69濃度計算公式為:
(1)
腹腔注射熒光標記肽COX52-69的血藥濃度-時間曲線及藥代動力學參數
根據陽性對照對實驗組進行計算,利用DAS 2.0繪制所得腹腔注射熒光標記肽COX52-69的血藥濃度-時間曲線及藥代動力學參數見圖2、表3。
近年來,越來越多的多肽藥物被開發并用于臨床。多數已被FDA批準并用于臨床的多肽類藥物具有用藥量少,選擇性強,特異性好,作用效果顯著,毒副作用小等優點[4]。COX52-69是從豬小腸中分離提取的一種短肽。為了更加準確的掌握短肽COX52-69在體內的吸收、代謝規律,就需要對其藥代動力學參數進行研究。本實驗對短肽COX52-69進行修飾,在其N端連接綠色熒光素FITC,對大鼠進行腹腔注射熒光標記肽COX52-69,利用熒光酶標儀對給藥后不同時段的大鼠血清進行檢測[5],通過陽性對照組求得大鼠血清的血藥濃度,利用DAS 2.0繪制血藥濃度-時間曲線。目前,對藥動學參數的研究大多采取HPLC、LC-MS,成本較高。該方法對肽類藥物藥動學參數的確立進行改良,可以快速確立短肽COX52-69的藥代動力學參數,同時具有低成本的優點。
利用DAS2.0對藥代動力學參數進行擬合,
表3 從大鼠血清中測得腹腔注射熒光標記肽COX52-69的藥動學參數