一種適用于微生物學實驗教學的改良細菌革蘭染色法

王繼璇

摘要微生物學實驗教學常規細菌革蘭染色實驗中，常因細菌培養物被反復使用而導致染色結果出現錯誤。為了提高革蘭染色實驗教學效果，我們建立了基于10%福爾馬林固定菌液的改良革蘭染色法。該法染色結果顯示，4°C或室溫放置5或30 d的福爾馬林固定金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌菌液不僅具有100%染色正確率，同時還有菌體染色均勻、輪廓清晰、形態典型等優點，不僅提高了革蘭染色實驗教學效果，同時也明顯減少了實驗準備工作量及細菌培養基使用量，較好的改進了革蘭染色實驗教學中存在的問題。

關鍵詞 微生物實驗教學 改良革蘭染色法 福爾馬林 細菌固定

中圖分類號：Q246文獻標識碼：ADOI：10.16400/j.cnki.kjdk.2021.20.018

A Modified Bacterial Gram-staining Method Suitable for Microbiologic Experimental Teaching

WANG Jixuan

（Zhejiang University， School of Medicine， Hangzhou， Zhejiang 310006）

AbstractIn the routine bacterial Gram-staining assay of microbiologic experimental teaching， the wrong staining results frequently occur due to the repeated use of bacterial cultures. In order to improve the teaching effect of bacterial Gramstaining assay， we established a modified Gram-staining method using 10% formalin-fixing bacterial suspensions. The stainingresultsoftheformalin-fixedsuspensionsstandingat4°Corroomtemperaturefor5or30dofStaphylococcusaureus， Bacillus subtilis and Escherichia coli using this modified method not only showed 100% correct rate， but also had the advantagessuchasuniformstaining，edgesharpnessandtypicalshapeofbacterialbodies，whichimprovedtheteachingeffect of Gram-stainingassay as well as decrease the work load of experimental preparation and usage of bacterial medium.

KeywordsMicrobiologic experimental teaching； modified Gram-staining method； Formalin； bacterial fixation

革蘭染色法是高等院校微生物學實驗中最為常用的細菌染色法，不僅可以輔助清晰地觀察細菌的形態，同時也能反映不同細菌細胞壁之間的差異并對臨床上抗生素的選擇具有參考價值。因此，醫學、農業、環境微生物學實驗教學中均將細菌革蘭染色法作為本科實驗教學的基本內容之一。然而，現行的革蘭染色法染色效果受到較多因素的干擾，包括細菌菌齡、細菌涂片厚度、乙醇脫色時間等的影響，導致最終染色出現假陰性、假陽性的結果，影響實驗教學效果。其中在各種影響染色效果的因素中，菌齡對染色結果影響最大，對數生長期的細菌染色結果正確性較高，幼齡或老齡菌染色后易出現假陰性或假陽性染色結果。[1]我國現行的實驗教學體系中，通常實驗班級較多，故對數生長期細菌往往保存于4°C冰箱貯存備用。但有文獻報道，細菌在4°C時仍可緩慢生長，故對數生長期細菌長時間4°C保存并反復使用后，已非處于對數生長期，從而影響革蘭染色結果的正確性。[2，3]

我們在長期的醫學微生物學實驗教學中發現，預先采用福爾馬林溶液固定待染色的細菌，可有效地消除菌齡對革蘭染色結果的影響，取得了良好的實驗效果。接下來筆者就改良后的革蘭染色法進行詳細的介紹，以期對同類實驗教學的開展起到一定的借鑒作用。

1實驗步驟與方法

菌種選擇及細菌培養：選擇金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌分別作為革蘭陽性球菌和桿菌、革蘭陰性桿菌代表。用火焰滅菌接種環挑取上述菌種接種于瓊脂平板或普通肉湯，37°C培養18 h，其中液體培養物定量OD600=1.0。

菌液制備及福爾馬林固定：上述用生理鹽水洗下的菌苔或細菌培養液2000r/min離心10min，取細菌沉淀懸于適量生理鹽水中，2000r/min離心10min，如此重復2-3次。部分離心獲得的細菌沉淀中加入適量10%福爾馬林溶液，混勻后室溫固定15min；將未用福爾馬林固定或福爾馬林固定的菌液在4°C或室溫下放置5或30 d，然后進行革蘭染色。

改良革蘭染色法：將適量福爾馬林固定菌液滴加于潔凈載玻片上，用接種環涂布成直徑約10mm薄而均勻的菌膜，常規火焰固定；滴加結晶紫染液覆蓋菌膜，室溫染色1 min，細小水流沖洗數秒后甩干；滴加盧戈氏碘液覆蓋菌膜，室溫染色1 min，小水流沖洗數秒后甩干；滴加95%酒精覆蓋菌膜，輕輕旋轉或晃動玻片，室溫脫色0.5min，小水流沖洗數秒后甩干；滴加石碳酸復紅染色液覆蓋菌膜，室溫染色1 min，小水流沖洗數秒后甩干，用吸水紙吸盡玻片上水份后用油鏡觀察。[4]

常規革蘭染色法：采用常規革蘭染色法染色對數生長期待染色菌種。[4]

細菌染色性判定：每種細菌與培養條件下均選取樣本數20，嚴格控制革蘭染色過程一致，染色結束后每張樣本撥片隨機選取3-5個單層細菌染色區進行顯微鏡下觀察，藍紫色為革蘭陽性、紅色為革蘭陰性。根據鏡下染色結果與標準結果比對結果確定染色結果的正確率。

2結果與分析

2.1不同溫度及放置時間對常規革蘭染色結果的影響

新鮮培養（37°C培養18 h）后行常規革蘭染色的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌染色結果正確率均為100%；4°C冰箱放置5天后的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌培養物革蘭染色正確率分別為90%、70%和80%，20°C室溫放置5天后金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌革蘭染色正確率分別僅為60%和50%，枯草芽孢桿菌染色結果均轉為陰性，具體見表1。

在顯微鏡下觀察，革蘭染色結果錯誤的金黃色葡萄球菌部分紫色紅色菌體參半，部分完全假陰性呈紅色；革蘭染色假陰性枯草芽孢桿菌著色變淺、不著色或呈紅色且菌體形態發生明顯變化，大部分菌體已出現芽孢；革蘭染色假陽性大腸埃希菌呈紫色且菌體變小，實驗結果見圖1。

革蘭染色結果的差異主要依據不同細菌細胞壁結構的不同，細菌在對數生長期細胞壁結構最為穩定，呈現典型的革蘭染色性。當細菌生長進入靜止期或衰亡期以后，隨著衰亡期細菌大量出現，菌體自溶現象的發生，細菌的菌體形態與細胞壁結構都發生了變化，從而出現假性染色結果。不同溫度（4°C，20°C貯存條件）下，細菌呈現相對緩慢生長，逐步進入靜止期或衰亡期，所以不同溫度對染色結果的影響也是通過對細菌生長狀態的影響進而影響染色結果。

2.2福爾馬林固定顯著增強染色結果穩定性

采用10%福爾馬林固定細菌的改良革蘭染色法時，新鮮、室溫放置5或30d金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌菌液的染色結果正確率均為100%且呈現典型的菌體形態，實驗結果見圖2。

10%福爾馬林固定處理后，細菌菌體內蛋白變性導致細胞死亡從而保持固有的菌體形態與結構，行革蘭染色法鏡檢后，細胞形態與染色結果均穩定，不受貯存溫度與貯存時間的影響，有效的解決了菌齡干擾染色結果的問題。

另一方面，10%福爾馬林固定處理后細菌菌液涂片相比于常規使用的斜面固體菌種涂片，更易于涂片均勻，出現單層分散菌體鏡像，對于初次接觸革蘭染色方法的學生實驗成功率更高。

3討論

不同細菌的細胞壁結構存在顯著差異，一類細菌細胞壁由細菌胞漿膜和大量肽聚糖組成，另一類為細菌胞漿膜（也稱內膜）、少量肽聚糖和外膜組成，這也是前者革蘭染色陽性、后者革蘭染色陰性的原因所在。[5]目前我國大多數高校微生物學實驗教學體系中，存在教學時間集中、學生人數龐大、實驗教師編制有限等特點，細菌革蘭染色實驗中通常無法及時培養和制備新鮮菌液，導致一次培養的細菌需在冰箱放置數天后使用，而不新鮮的菌液直接影響革蘭染色的結果，學生染色結果出現異?；蝈e誤在我們的日常教學中時有發生。我們的實驗結果顯示，4°C放置5天后分別有10%、30%和20%的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌菌液革蘭染色結果出現錯誤，室溫放置5天后金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌常規革蘭染色結果的錯誤率分別高達40%和50%，枯草芽孢桿菌染色結果甚至全部轉為陰性，同時還出現枯草芽孢桿菌和大腸埃希菌出現不典型的菌體形態，不僅影響了實驗教學效果，也易使學生實驗成績評分出現誤判。因此，探索并建立穩定可靠的細菌革蘭染色法在微生物實驗教學中具有較大實際意義。

福爾馬林是組織病理學檢查技術中常規使用的組織固定劑，可與組織及細胞中蛋白分子的氨基結合并使其固定化，從而有效地保持了組織及細胞的形態和結構。[6]我們將福爾馬林組織固定的方法借鑒應用到了細菌學中，研究結果顯示，采用10%福爾馬林固定細菌而制備的菌液，可在4°C或室溫放置30 d內保持染色結果的正確性，同時還有菌體染色均勻、輪廓清晰、形態典型等優點，不僅提高了實驗教學效果，同時大大減輕了實驗準備的工作量并減少了培養基的使用量。室溫放置30 d是我們實驗測試的放置時間，更久的室溫放置時間可以進一步的進行驗證。此外，阿培脫染色法染色白喉棒狀桿菌實驗也是病原微生物學教學實驗中常用染色方法，白喉棒狀桿菌的異染顆粒常因細菌多次傳代或培養物老化而使異染顆粒不明顯甚至消失，[7]從而影響染色結果。探索福爾馬林固定的白喉棒狀桿菌阿培脫染色能否顯示穩定且典型的異染顆粒，值得我們后續進一步的研究。

參考文獻

[1]洪慶華，遲杰，齊云，等.影響革蘭氏染色結果的原因分析[J].實驗技術與管理，2011，28（5）：41-43.

[2]王芳，葉寶興，宋瑛琳，等.微生物學實驗中革蘭氏染色兩種方法的比較[J].實驗室研究與探索，2007，26（8）：123-124.

[3]周智慧，高波，王升智，等.不同保存方法對重組大腸桿菌菌株活性的影響[J].安徽農業科學，2010，38（1）：8-9，15.

[4]李立偉，鮑建芳.感染與免疫學實驗教程.第一版[M].杭州：浙江大學出版社，2015：7-8.

[5]嚴杰.醫學微生物學.第一版[M].北京：高等教育出版社，2008：317.

[6]趙寶忠，孫智才，劉增輝，等.對福爾馬林固定劑相關理論的再認識[J].臨床與實驗病理學雜志，2009，25（3）：337-338.

[7]張瑞其，徐仙赟，李小花，等.白喉棒狀桿菌異染顆粒重現的實驗探討[J].贛南醫學院學報，2010，30（1）：12.