間充質干細胞旁分泌作用的研究進展

王媞爾 史明霞

昆明醫科大學第一附屬醫院血液科，云南省血液病研究中心（昆明650032）

間充質干細胞（MSCs）是一組來源于中胚層間充質，具有自我更新能力、多向分化潛能特性的非造血成體干細胞，其普遍存在于外周血、骨髓、臍帶、臍血以及脂肪等組織中。在合適的條件下，MSCs 可在體內或體外被誘導分化為成骨細胞、軟骨細胞、神經細胞、胰島樣細胞、肝臟細胞、心肌細胞以及脂肪細胞等。

目前來說，MSCs 自身的低免疫原性和免疫調節特性已被應用于臨床干細胞移植治療，但是其免疫調節的可塑性等問題常導致MSCs的療效出現異質性和不穩定性。近年發現MSCs移植的方案在實驗或臨床上不僅沒有達到可用于治療的水平，而且可能會出現異常分化、毒性、免疫反應、栓塞形成和發生腫瘤的風險［1］，這些因素均會導致MSCs 的應用被限制。不少研究發現，在經體外培養后，MSCs的歸巢率也出現了明顯降低。有證據表明，移植的MSCs 在靶組織中實際能夠定位且存活的量極少，且它不是依靠分化機制而是以旁分泌的方式來發揮改善器官功能及調節治療的作用［2］。

MSCs 不但可以合成和分泌廣泛的可溶性因子（細胞因子、生長因子和趨化因子），也可以分泌細胞外囊泡（EV）。前者對其周圍的細胞的確可以產生部分影響［3］，但無一能夠充分表現MSCs 的功效。而后者是從細胞膜上脫落或者由細胞分泌的雙層膜結構的囊泡狀小體，直徑從40 nm 到1 000 nm 不等，主要由微囊泡（microvesicles，MVs）和外泌體（exosomes，Exs）組成，它們一旦釋放到細胞外環境中，可以通過旁分泌調節作用于附近的受體細胞，來介導對其他細胞的作用。MVs 是細胞在損傷、激活或凋亡后由細胞膜向外脫落釋放的小囊泡（直徑約為100 ～1 000 nm）；Exs 是首次在綿羊網織紅細胞上清液中被發現的一種膜性囊泡（直徑30 ～150 nm），主要來源于細胞內溶酶體微粒內陷形成多泡體，經多泡體外膜與細胞膜融合后分泌到胞外，其攜帶有母細胞中的蛋白質、核酸以及脂質等重要成分［4］。

目前大部分培育的哺乳細胞類型都可以分泌EVs，且廣泛存在于血液、唾液、腦脊液、尿液和乳汁等體液中。許多文獻記載，差速超速離心法是EVs 分離提取技術中最常用的方法。但為了保持提純率和特異性的穩定，近年來多數研究者將此法聯合其他技術一并使用，例如密度梯度、過濾、沉淀、大小排斥層析和免疫分離法等；并且開發出其他技術或技術組合的多項互補法，其效果明顯優于單一方法。在制備EVs 方面，盡可能完善對其來源的定量檢測，保證內含物的豐富性、維持其特異性亦是必要的［5］。

人們逐漸發現EVs 與細胞療法明顯不同的是其相對穩定和可存留，并在同種異體給藥后呈現出的免疫排斥率亦較低［2］。以往關于細胞間作用的多數研究主要關注在MSCs產生的可溶性因子方面，而目前了解到EVs 才是胞間通訊的真正的重要介質［6］，且MSC-EVs 不僅具有母細胞的生物學活性，也能規避在MSCs 治療應用中的弊端，成為潛在的治療方法或治療劑的運送載體［7］。

1 在心肌修復中的研究

近年來，我國冠心病的發病率逐年升高，而心肌再灌注治療策略對于心肌梗死的患者尤顯重要。在冠狀動脈發生部分或急性阻塞后，予以再通治療，雖其目的是為了恢復心肌供血、減少損傷或持續壞死的心肌細胞，但在此過程中可能會通過激活某些信號轉導通路而致心肌細胞死亡和功能惡化，發生心肌缺血/再灌注損傷（myocardial ischaemia/reperfusion，MI/R）［8］。然而，當血管再通后，在缺血期引起的損傷卻更加凸顯，甚至會發生嚴重的心律失常而致猝死，如在心內直視手術、冠狀動脈搭橋術或腔內成形術、溶栓術后以及心肌內側支循環血量突然增加等情況下可能出現［9］。目前其發生機制尚未明確，但有研究表明可能與細胞內氧自由基增多［10］、鈣超載、炎癥反應以及能量的代謝紊亂等因素的參與有關［11-12］?，F今尚無明確有效治療MI/R 的方法，人們將眼光聚焦于藥物和細胞治療的方向，但考慮藥物治療有時間依賴性，遂MSCs 治療MI/R 逐漸成為研究者應用治療的新目標。此外，在干細胞移植治療中，暫無很好辦法使MSCs 有效分化為心肌細胞，且移植中有很多副作用問題尚未明確，但Exs 修復損傷組織的能力卻逐漸被發現。當缺血再灌注后，MSC-EVs 可以通過傳遞miRNA或某種蛋白質來調節能量的代謝平衡、避免鈣過載、激活促存活通路、抑制死亡受體通路以及改善缺血微環境來進一步抑制細胞的凋亡。MAO 等［13］將轉染了KLF3-AS1 基因的hMSCs-Exs 注射至心肌梗死大鼠模型中，或用hMSC 條件培養液培養缺氧心肌細胞，發現hMSCs-Exs 中KLF3-AS1的過表達可以顯著減少心肌梗死面積，減少細胞凋亡，且Exs 抑制劑可以逆轉條件培養液中促進細胞存活的功能。有觀點認為MSCs-Exs 可以通過miR-182 調節巨噬細胞的狀態來減輕小鼠心肌I/R損傷［14］。此外，MSC-Exs 還可通過誘導心肌細胞的自噬，來減少細胞凋亡，促進心功能的改善［15］。

2 在呼吸系統中的研究

有研究發現MSCs 在減輕多種類型的肺損傷治療中是安全且可行的［16］。MSCs 效應的重要作用是在損傷部位向特定細胞的分化，而不少研究發現，體內注射MSCs 的確可以改善損傷、減少破壞，但其在損傷部位的植入較少且存活短暫，分化程度也非常低，發揮保護機制的主要是其釋放的旁分泌因子［17］，且條件培養基可以同細胞一樣發揮促進修復及分化的作用［18］。慢性阻塞性肺病易引起肺動脈高壓（PH），常致右心衰竭及死亡，當今治療手段仍無法徹底逆轉病情的進展并改善生存率。王英宏等［19］發現大鼠的MSC-EVs 能明顯減低自身的肺動脈壓及右心室壓力，緩解肺血管與右心室重構，減輕組織纖維化的程度，對炎癥細胞發揮部分抑制作用。

近年支氣管哮喘的發病率增長與氣道反應性增高相關。MSCs 和調節性T 細胞（Tregs）均是強有力的免疫調節劑，Tregs 的異常增殖和功能在哮喘的發生發展中起至關重要的作用，而MSCs 可通過其免疫調節特性改善多種免疫介導的疾病。在小鼠模型全身施用MSC-EVs 能夠通過miR-146a-5p抑制先天性淋巴樣細胞在哮喘疾病中的主導功能，從而減輕氣道高反應性［20］。有學者通過分離出MSC-EVs，研究其對哮喘患者外周血單個核細胞（PBMC）的免疫調節作用時發現，MSC-EVs 可上調PBMC 中IL-10 和轉化生長因子β-1 的表達，促進Tregs 的增殖和免疫抑制能力，表明其在免疫調節中可發揮重要作用，且在治療哮喘疾病中具備巨大潛力［21］，是極有前途的無細胞治療劑。

3 在免疫調節中的應用研究

MSCs 由于自身突出的免疫抑制潛能已經在眾多領域中獲得了廣泛的研究。近年來，許多臨床前和臨床試驗研究表明，MSCs 在體內外的免疫抑制潛能可以改善許多免疫介導的疾病，如自身免疫性疾病，主要有系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎、急性移植物抗宿主病、自身免疫性肝炎、慢性腎臟病等，而支持MSCs 免疫調節作用的一個關鍵機制是產生旁分泌因子。

隨著研究的進展，逐漸發現MSC-EVs 可能通過多種機制改善腎臟疾病模型中的腎臟損傷，包括急性腎損傷和慢性腎臟疾病，這些機制包括免疫調節和再生作用。例如，MSC-EVs 可通過降低炎性細胞因子表達水平和減少細胞凋亡來改善腎臟缺血再灌注損傷［22］。在環孢菌素引起的慢性腎臟毒性的小鼠模型中，予以MSCs 條件培養液似乎也會呈現出同MSCs 一樣的優勢效果，促進部分腎功能恢復，減少細胞凋亡和組織纖維化，進一步改善預后，表明MSCs 植入的細胞療法并非是必要的［23］。

目前異基因造血干細胞移植是難治性血液病可能唯一的治療方法，但易引起急性移植物抗宿主?。╝cute graft-versus-host disease，aGVHD）的發生，此時抑制aGVHD 的出現是移植成功的關鍵環節。盡管皮質類固醇激素是aGVHD治療的首要方案，但對類固醇激素耐藥的患者可高達50%，致最終治療效果欠佳［24］。后續發現MSCs可作為新的治療方法，但考慮到MSCs臨床應用的安全性問題及其分泌機制等因素，許多研究者選擇使用MSC-EVs來進行臨床前及臨床試驗研究。LI 等［25］在小鼠體內外實驗研究中發現，人臍血源性的MSCs-EVs 可通過調節免疫反應來預防危及生命的aGVHD 的發生及降低其嚴重程度，顯著提高了存活率。KORDELAS等［26］通過使用MSC-EVs 治療aGVHD 患者后發現，MSC-EVs 可顯著緩解患者腹瀉、皮疹及感染等臨床不良反應，從而減少類固醇用量，改善預后。

自身免疫性肝炎是一種難治型疾病，目前除類固醇激素外，暫未發現其他有效的醫治方法。FENG 等［27］發現可通過利用MSC-Exs 作為載體的特性，使其攜帶microRNA-223-3p 運送到細胞內來調節免疫、抑制炎癥反應、減輕肝損傷，為自身免疫性肝炎的治療提供一個新興的方向。

以上許多研究表明，MSC-EVs 的無細胞療法已然成為免疫調節和治療免疫介導性疾病的一種有潛在的安全療法。

4 其他疾病中的應用研究

近年來，不少患者被神經損傷引起的神經病理性疼痛所困擾，且治療困難。SHIUE 等［28］發現人臍帶間充質干細胞（UCMSC）來源的外泌體可在大鼠神經損傷所致的疼痛模型中發揮有效的預防和逆轉功效，同時兼具抗炎及前神經營養作用，也可將無細胞療法認為是未來治療神經損傷所致疼痛的新策略之一。XIE 等［29］在臍帶血-間充質干細胞（CB-MSC）共培養系統中加入MSC-MVs 后，發現其能夠顯著提升臍血中CD34+細胞的擴增量，且原始祖細胞的增殖量也明顯高于MSCs 共培養系統，在調節MSCs的造血支持作用上亦做出了貢獻。SHI等［30］在大鼠尿道損傷模型中局部應用MSC-Exs 后證實其可減輕組織纖維化、促進血管生成，可有效防止尿道狹窄的出現。

5 小結及展望

MSCs 的旁分泌作用（特別是MSC-EVs）雖然使得無細胞療法看似在治療多種疾病中很有潛力，但在臨床應用上仍然存在巨大的挑戰，為了使其成為標準的診斷工具和更加優化的治療方法，有待進一步的研究。