內生真菌對金線蓮栽培生長發育的影響研究

楊開興

(邵武將石省級自然保護區管理處，福建 邵武 354000)

1 引言

金線蓮是一種蘭屬多年生草本植物，是能夠全草入藥的具有清熱解毒、祛風祛濕等功效的名貴中草藥。隨著中醫藥研究的深入有效應用于高血壓、糖尿病、心臟病、肺炎、肝炎等慢性高發病率疾病的控制治療中，具有獨特療效。自然生長條件下的金線蓮因對生長環境要求較高，導致生長緩慢，加之金線蓮生長環境遭到人為破壞和隨意采挖，野生的金線蓮數量稀少，難以滿足現代疾病治療的需求[1]。蘭科植物種子細小，并且使用人工無性繁殖難度系數高，雖然試管培養初見成效，但是組培苗出瓶栽培困難依據很多。分析自然界蘭科植物的生長環境可知，所有的蘭科植物都與真菌共生，真菌通過自身的生長代謝為蘭科植物提供生長所必須的碳水化合物[2]。金線蓮的生長發育與內生真菌密不可分，內生真菌能夠促進金線蓮形態發育、體內代謝產物累積，提高植物抗性，對金線蓮的生長、代謝、抗病性和品質有著非常重要的影響。由于金線蓮根際真菌環境復雜，不同種類的共生真菌對金線蓮的促進效應具有潛在特異性。

基于以上內容，本文將從野生金線蓮根際分離內生真菌，回接金線蓮組培苗進行人工栽培。通過觀察組培苗的生長態勢，探究內生真菌對金線蓮栽培生長發育的影響，為提高人工栽培金線蓮的內在質量提供實驗依據。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

本次實驗選擇來自4個不同產地的野生金線蘭植株各5株，作為金線蓮內生真菌的分離和純化的操作對象。金線蓮生長培養影響研究材料為無菌實驗室中人工栽培的無菌試管苗共60株，無菌試管苗的苗高2～3 cm，根長0.5～1.5 cm。

野生金線蓮內生真菌菌株的篩選儀器和試劑：超凈工作臺、立式壓力蒸汽滅菌器、凈水器、光照培養箱、電熱恒溫鼓風干燥箱、生物顯微鏡、離心機、含蔗糖和瓊脂的MS培養基、無水乙醇以及試管、錐形瓶若干[3]。

內生真菌影響金線蓮組培苗生長發育測試用到的儀器和試劑：超凈工作臺、立式壓力蒸汽滅菌器、光照培養箱、電熱恒溫鼓風干燥箱、硝酸銨、硝酸鉀、硫酸鎂、肌醇、無水乙醇、蔗糖、瓊脂、不含蔗糖和瓊脂的MS培養基以及培養皿、錐形瓶若干[4]。

2.2 實驗菌株的分離和純化

選用來自4個不同產地的新鮮野生金線蓮植株作為實驗菌株提供來源。去除新鮮野生金線蓮的根、莖、葉表面的泥土、腐爛葉片、雜草等雜質，并在自來水下沖洗干凈。用無菌濾紙吸干金線蓮植株表面的水分，分別針對植株的根、莖、葉進行表面消毒處理。按照1 min 75%乙醇、4 min 2.5%次氯酸鈉、1 min 75%乙醇的順序對于金線蓮植株的根部表面進行消毒；按照1 min 75%乙醇、3 min 2.5%次氯酸鈉、1 min 75%乙醇的順序對于金線蓮植株的莖進行消毒；按照1 min 75%乙醇、1 min 2.5%次氯酸鈉、30 s 75%乙醇的順序對于金線蓮植株的葉片表面進行消毒[5]。

對金線蓮的根、莖、葉表面消毒后，無菌水沖洗4次并吸干表面水分。使用無菌工具在不同金線蓮植株的各個部位取一定大小的組織塊，將組織塊放在青霉素濃度為50 mg/L的PDA培養基中。在25℃的恒溫環境下培養真菌[6]。當培養基中的組織塊切面長出肉眼可見的菌落后，挑取菌絲于干凈的PDA培養基中培養，重復挑取培養步驟，得到純化后的金線蓮內生真菌菌株。將不同菌落的內生真菌菌株標號，以便于后期分析。

2.3 菌株轉接至金線蓮組培苗處理

金線蓮組培苗在分化培養基中進行分化培養，通過調整培養基內的營養成分含量，得到處于瓶苗、小苗、中苗三個不同分化時期的金線蓮組培苗[7]。

金線蓮組培苗與內生真菌的共培養配置組分為：825 mg/L的硝酸銨、950 mg/L硝酸鉀、185 mh/L的硫酸銨、100 mg/L的肌醇、蔗糖15 g/L、瓊脂14 g/L，將上述組分融合后調整pH值為5.8。以上無機培養組分占培養基基體成分的1/3，剩余2/3為MS培養基的有機成分[8]。

將純化后的金線蓮內生真菌菌株按照不同菌株種類分別接種至培養瓶中央，在培養瓶中與金線蓮組培苗共培養。設置不接種內生真菌菌株只培養金線蓮組培苗作為對照空白組[9]。將共培養的內生真菌菌株和金線蓮組培苗放置在24～26 ℃、光照強度為1500 lux、光照周期為12 h的條件下，培養14 d，每天觀察內生真菌及組培苗的生長狀況。14 d后，移栽繼續種植。

2.4 不同時期金線蓮組培苗處理

將所有共培養金線蓮組培苗中成活的苗按照不同苗期進行移植栽培處理。將成活的瓶苗煉苗，并用在120 ℃高壓2 h滅菌后的苔蘚植入穴盤中種植。移植前稱量瓶苗鮮重，移植后150 d統計移植苗的成活率、成活苗的鮮重[10]。

將腐殖質和蛭石按照3∶1的比例，并混入一定量的棟樹葉片和固態菌株配置為小苗和中苗的盆栽基質。將配置好的盆栽基質等量裝入盆口直徑為10 cm、盆底直徑6 cm,盆高7 cm的帶孔花盆中。將共培養后的小苗和中苗的固體培養基成分沖洗干凈，并消毒小苗和中苗的根、莖、葉表面。將花盆中的基質澆水后，按照小苗每盆2株、中苗每盆1株的標準分別移栽小苗和中苗。將移栽后的金線蓮放入溫室中，在溫度為24 ℃、濕度93±1%、光照強度為1300 lux的條件下培養盆栽苗[11]。金線蓮苗體移栽前，稱量苗體鮮重，并在培養100 d后，統計移植苗的成活率、成活苗的鮮重。

2.5 統計學處理

3 結果與分析

在對實驗菌株的分離和純化過程中，共獲取5種金線蓮內生真菌。將4種金線蓮內生真菌分別標記為01～05號菌。將內生真菌與不同生長周期的金線蓮共培養，觀察金線蓮生長狀態，統計金線蓮生長相關數據并分析處理后得到相應結論。

3.1 內生真菌對金線蓮瓶苗的生長發育影響

金線蓮瓶苗和不同種類內生真菌共培養150 d，在培養期間，實驗組和對照組金線蓮瓶苗的生長數據，以及培養結束后，兩組金線蓮苗的干重增加量、苗高增加量、鮮重增加量、氣生根和基生根數量變化數據如下表所示，分析表1中數據，研究內生真菌對金線蓮瓶苗的生長發育影響。

表1 內生真菌對金線蓮瓶苗的生長發育影響數據

經過統計計算，與內生真菌共培養的金線蓮植株的成活率為96.2%，對照組未與內生真菌共培養的金線蓮植株的成活率為43.7%。從與內生真菌共培養的金線蓮植株共生基表面部分呈現的形態上來看，在02和03號菌的作用下，金線蓮瓶苗的生長速度處于本次實驗所有組別的中的偏下。02和03號菌的菌落在共培養60 d后，菌落約占培養基的1/2，與對照組金線蓮植株相比較為粗壯，黃色葉片數量較少。與01和05號菌共培養的金線蓮瓶苗生長速度最快，在共培養40 d后，01和05號菌的菌落長滿整個培養基。但是與對照組瓶苗相比較，與01和05號菌共培養的金線蓮瓶苗的黃葉相對較多。與04號菌共培養的金線蓮瓶苗生長速度中等，菌落在共培養85 d時長滿培養基，并且與04號菌共培養的瓶苗生長態勢最好、氣生根發達。與5種內生真菌共培養時，金線蓮瓶苗的鮮重、干重都有顯著提高。5種內生真菌對金線蓮瓶苗的氣生根有非常明顯的促進作用，其中作用效果最佳的共生培養組相比增加了約43.8%。5種內生真菌對金線蓮瓶苗基生根的促進作用有限，但相比對比組仍有所提升。

內生真菌對金線蓮瓶苗的成活率有明顯的促進作用，并且能夠促進瓶苗氣生根的發育、鮮重的增加，提高瓶苗的抗性。移栽后的瓶苗長勢依舊良好，表明內生真菌能夠保護金線蓮生長、促進金線蓮吸收營養物質。

3.2 內生真菌對金線蓮小苗的生長發育影響

不同內生真菌與金線蓮小苗共同培養后，在小苗盆栽階段通過噴灑添加菌種的藥劑對小苗重復接種相同種類的菌種。統計金線蓮小苗的各項生長數據，具體的數據如表2所示。

表2 內生真菌對金線蓮小苗的生長發育影響數據

驗證組金線蓮小苗在生長過程中繼續噴灑不同種類的內生真菌溶劑，小苗移栽至花盆栽培的100 d內，驗證組小苗的整體長勢都好于對照組金線蓮小苗。噴灑了內生真菌的小苗植株根、莖相比對照組更加粗壯，葉片數量明顯多于對照組小苗，而且驗證組金線蓮小苗的黃葉數量少于對照組小苗。對于噴灑了不同種類內生真菌的對照組金線蓮小苗，生長過程噴灑了01和04號內生真菌的小苗鮮重和干重增加量相比較多，且噴灑兩種內生真菌的小苗氣生根增加量較多。而實際的小苗生長狀態也可發現，噴灑了兩種真菌的小苗生長速度明顯快于噴灑了其它種類菌種的小苗；噴灑02號和03號內生真菌的小苗生長速度、干鮮重增加量、氣生根增加量都相比于對照組其它小苗較少，但是其基生根的增加量較多，整體小苗的根系在花盆中生長深度較深；噴灑05號內生真菌的小苗鮮重和干重增加量處于中等，氣生根增加量較少，但相比其它對照組小苗，該組小苗的黃葉比例最低，植株高度雖相比較矮，但是植株的莖部相比更加粗壯。在100 d移植培養后，噴灑了01和04號內生真菌的小苗已經進入下一生長周期，植株生長態勢優于噴灑其它種類真菌。綜上所述，01和04號內生真菌能夠有效縮短金線蓮小苗的生長周期、促進小苗的快速生長；02號和03號真菌能夠促進金線蓮小苗基生根向栽培基質更深處生長；05號真菌能夠促進金線蓮小苗的莖、葉生長，使得植株莖部粗壯、葉片更加健康。

3.3 內生真菌對金線蓮中苗的生長發育影響

不同組金線蓮中苗在4種內生真菌的分別作用下，生長發育的具體數據如表3所示。分析表3中數據，結合植株生長情況，得出相應結論。

表3 內生真菌對金線蓮小苗的生長發育影響數據

金線蓮中苗在移植并噴灑不同內生真菌溶劑栽培100 d后，苗體長勢略微優于對照組中苗的苗體長勢，對照組之間對比，噴灑了03號真菌的金線蓮中苗的長勢相比較好。噴灑其它4種內生真菌的金線蓮中苗生長態勢相差不多。以上數據表明，在金線蓮中苗的生長過程中，噴灑內生真菌的植株長勢有一定提升，03號真菌的促進生長作用較強。

綜合以上3組實驗結果，內生真菌對金線蓮中苗的生長作用非常有限，遠不及對金線蓮瓶苗、小苗生長發育的促進效果。

4 結語

內生真菌廣泛存在于蘭科植物中，為高質量、大規模地人工培養出品質良好的金線蓮，本文研究了內生真菌對金線蓮栽培生長發育的影響。在本次實驗中提取的內生真菌對金線蓮不同時期的植株生長都有一定的促進作用，但是野生金線蓮根際微生物環境復雜，仍需要更多的研究數據為人工栽培金線蓮提供理論支撐。為深入研究內生真菌對金線蓮生長發育的影響，未來將進一步研究內生真菌復合作用以及數量對金線蓮不同時期植株的生長發育影響。