水果香氣物質分析研究進展

肖作兵，蔣新一，牛云蔚

(上海應用技術大學 香料香精化妝品學部，上海 201418)

水果的風味、外觀顏色以及營養價值是其關鍵的品質特性，香氣是影響消費者偏好的主要因素之一[1]。水果中的揮發性香氣物質種類繁多，主要由酯、醇、醛、酮、內酯、萜類組成[2]，但微量成分也可能起著關鍵作用，如微量的硫化物與其他化合物結合給熱帶水果帶來了誘人的熱帶風味[3]，這說明了在眾多揮發性物質之間找到關鍵香氣物質及分析可能存在的相互作用對香氣的研究意義重大。

本文從揮發性游離態香氣和鍵合態香氣物質兩個角度分別介紹了目前水果香氣物質的研究進展，并根據水果的特點概述了水果香氣物質提取技術的選擇，分析了主要方法的優缺點，以及鑒定水果關鍵香氣物質的方法。為了更好地全面了解香氣物質的相互作用，在香氣感知角度上，闡述了香氣物質協同作用和基質- 香氣物質相互作用對整體香氣的影響，為水果及其加工產品改善香氣以及提高質量品質提供了理論依據，同時為研究水果香氣物質及其變化規律提供了新的思路。

1 水果香氣存在形態與提取鑒定

1.1 水果香氣物質的存在形態

1.1.1游離態香氣物質研究

水果中芳香物質主要以游離態和鍵合態形式存在，其中游離態香氣物質具有揮發性，能夠直接被感知。游離態揮發性物質主要用來呈現水果中的香氣。目前對于水果中的游離態揮發性香氣物質對比研究集中在同一水果的不同品種、不同部分(果皮、果汁、果肉等)導致不同香氣差異分析上，為水果的進一步加工利用提供研究依據[4]。

同時，許多因素影響著游離態揮發性成分，包括遺傳、成熟度、環境條件、收獲后加工和儲存等，這些因素決定了果實的特性和感知品質。目前國內外大多圍繞著成熟度(不同生長階段)和儲存加工方式展開。Dou等[5]研究了收獲季節對香蕉揮發性香氣物質的研究，研究發現三月份收獲的香蕉具有更多的揮發性香氣物質，為產品采收提供了理論依據。橘子[6]、楊梅[7]、桃子[8]等水果也展開了成熟度香氣變化規律相關研究。

水果在加工過程中不可避免的會導致游離態香氣物質的損失或可能產生異味，不同的儲存方式也會對水果香氣特征有很大影響[9]。郭艷峰等[10]分析了不同干燥方式對百香果揮發性風味成分的影響，發現真空冷凍干燥基本能夠保持原有的風味。張義[11]研究了不同儲藏溫度、時間對龍眼汁香氣物質的影響，結果表明龍眼汁更適合低溫短時儲藏。

1.1.2鍵合態香氣物質研究

近幾十年來，游離揮發性物質的研究取得了很大進展。然而，糖苷結合的鍵合態芳香化合物受到的重視遠少于游離芳香化合物。鍵合態香氣物質也稱風味前體物，是一類不具有揮發性的物質，其含量遠超于游離態揮發物，一般與水果中的糖類物質通過糖苷鍵結合，以糖苷形式存在，嗅覺不容易感知[12]。在果實成熟過程中，鍵合態揮發性物質的糖苷鍵在水解和高溫等條件下可能發生斷裂[13]，以游離態形式被釋放進而被感知，從而增強整體香氣和改變水果香氣，是水果芳香的潛在香氣來源。

目前，已有對水果鍵合態香氣物質與果實成熟規律聯系起來的研究報道，包括獼猴桃[14]、葡萄[15]、桃[16]、草莓[17]等。

為解決水果及其產品在加工或儲藏過程中的香氣損失，提高產品質量、保持產品香氣完整，一般會添加食用香精，但得到的產品香氣缺乏天然感，而通過酶解[18]或酸解[19]水果中的糖苷香氣前體物質釋放香氣能夠獲得天然的香氣來改善產品香氣、增強品質。目前，該方法已成功應用于橙汁[20-21]、刺梨汁[22]、獼猴桃酒[23]等水果產品增香上。因此，鍵合態香氣物質釋放技術已經成為增強或維持水果及其加工副產品的香氣質量的有效生物技術手段。

1.2 水果香氣物質的提取與鑒定

1.2.1水果香氣物質的提取技術

水果基質復雜，有些對風味起關鍵作用的成分濃度低、不穩定，只有選擇合適的萃取方法，才能準確高效地分析出水果中的揮發性成分。

新鮮水果的獨特風味會因加熱而改變。因此，在提取新鮮水果風味物質的過程中應盡可能限制加熱處理，不破壞水果的天然風味。而大多數分離和濃縮技術需要不同程度的熱處理，這會對分析結果帶來較大影響。目前從水果中分離和富集揮發性成分的行業標準是溶劑輔助風味蒸發(solvent-assisted flavor evaporation,SAFE)，該方法比其他蒸餾技術更加受到研究人員的青睞，因為它限制了熱效應，該方法已廣泛使用在西瓜[24]、覆盆子[25]、番茄[26]、芒果[27]等水果富集揮發性物質的研究上。SAFE的提取率很高，包括極性、揮發性較小的風味成分，這些成分對許多風味類型都很重要，因此提取物的香氣特征與自然香氣十分相似，但提取所需的樣品量大且操作復雜、耗時長。

頂空- 固相微萃取(headspace-solid phase microextraction,HS-SPME)作為一種新的提取方法已被廣泛用于水果香氣物質的提取。與傳統的萃取技術相比，SPME具有高靈敏度、低成本、無溶劑、操作簡單的特點[28]，但HS-SPME分析結果受許多因素的影響，如纖維涂層、提取時間、樣品大小等[29]。

靜態頂空(static headspace,S-HS)比SPME更簡單，更快，并且可以實現自動化，但是其靈敏度較低。

從考慮基質效應角度，蒸餾和溶劑萃取技術并不適合新鮮水果的風味物質提取，因為它們破壞了基質效應。而SPME的萃取嚴格取決于分析物在樣品基質、頂空氣體和纖維涂層之間的分配系數。同時，頂空技術允許檢測高揮發性化合物，并且考慮了從基質中的動態釋放。SPME提出后不久,在此基礎上報道了攪拌棒吸附萃取(stir bar sorptive extraction,SBSE)技術，它具有與SPME相同的優勢，但由于使用了更多的固定相，因此其靈敏度提高了約100倍且具有更好的萃取能力[30]，在液體果汁的風味物質研究中使用率較高。

目前很多文獻研究了對比多種提取水果揮發性物質方法的不同，如Barba等[31]使用了SPME、SBSE、SAFE等方法對比了提取果汁中的揮發性成分，結果表明：SAFE得到可以鑒定的化合物最多，SBSE次之，SPME最少。

SPME能有效地萃取醛、醇和酮[32]，而SAFE萃取硫化合物的效率更高[33]。當研究相對分子質量較大，更疏水的分子(例如游離脂肪酸和內酯)時，蒸餾和溶劑萃取最為有效[34]。任何提取技術都不能對樣品揮發性物質進行完整的分析，但是它們可以相互補充。

1.2.2關鍵香氣物質鑒定技術

區別關鍵香氣物質與其他揮發性化合物也是一個重要的問題，因為并非所有揮發性化合物都存在可感知的氣味。盡管通過對水果的揮發性成分進行儀器分析，可以檢測到數百種揮發性物質，能夠直觀地了解其香氣成分，但它們對氣味的貢獻通常與它們的含量沒有直接關系，揮發物含量高的物質可能不會在香氣中起主要作用，只有極少數會對總體風味有實質性影響。這些少數重要風味化合物即水果的香氣活性成分或關鍵香氣物質。

目前通過氣相色譜- 嗅覺辨別法(gas chromatography-olfactometry,GC-O)篩選，使用香氣活性值(odor activity value,OAV)計算來確定水果中關鍵香氣成分已成為有力的工具。

為解決香氣強度無法評價的問題，研究人員開發了香氣萃取稀釋分析法，時間強度法和檢測頻率法等稀釋方法來配合GC-O使用。

同樣，僅僅通過上述方法也不能夠全面評價香氣物質對風味的貢獻，如目前較為廣泛使用的香氣萃取稀釋分析法只能表現出香氣相對強度，并沒有考慮到基質效應[35-36]。所以引出了香氣活性值的概念，它等于食物中揮發性成分的濃度與其在食物中檢測閾值的比值，能夠分析某個香氣物質對整體香氣的貢獻，通常我們把OAV≥1的香氣物質作為對整體香氣有貢獻的成分且OAV值越大，該成分對整體香氣的貢獻就越大。它的應用在食品領域得到越來越多的推廣[37]，且已鑒定出桑果[38]、楊梅[39]、哈密瓜[40]等水果的關鍵香氣物質。

但OAV的計算并未考慮到香氣物質之間的協同作用，為解決局限性，目前食品風味研究加入了香氣重組、遺漏實驗：通過重現特征香氣輪廓，檢驗篩選結果來驗證關鍵香氣物質的有效性與準確性。Munafo等[41]通過香氣萃取稀釋分析法,OAV計算得到芒果中24種關鍵香氣物質，并首次使用香氣重組、遺漏實驗法來驗證芒果的香氣，最終確認了15種香氣物質是芒果的關鍵香氣物質。該方法已被研究人員應用于蘋果[42]、蔓越莓[43]、柑桔[44]、榴蓮[45]等水果關鍵香氣物質分析上，還應用于鑒定加工后水果的異味物質[46]等領域。

2 水果香氣物質的感知相互作用

僅了解揮發性成分和濃度不足以完全解釋水果的整體風味。而揮發性香氣物質之間的相互作用，香氣物質與基質之間的相互作用都可能影響水果香氣成分的揮發性、香氣釋放以及整體感知的香氣強度與質量。對香氣感知相互作用的分析是研究水果復雜香氣物質的重要組成部分。

2.1 香氣物質之間的相互作用

香氣化合物對天然產品總體香氣的貢獻并不等于是揮發性化合物的總和。影響整體香氣的不僅是OAV大于1的化合物，不能忽略OAV小于1的揮發性化合物對整體香氣和化合物之間相互作用的貢獻[47]。有研究表明香氣化合物對總香氣的貢獻取決于其OAV。但是，應用OAV評估香氣化合物的作用是基于這樣的假設：香氣化合物之間沒有相互作用[48]。實際上，混合物中的香氣化合物之間存在復雜的感知相互作用，無法從每種揮發物的比例和濃度中預先確定系統的總體香氣。香氣揮發物彼此相互作用，以相互促進或抑制某些總體結果，因此引出了很多香氣協同作用研究。目前，研究香氣化學物質之間相互作用的方法主要有閾值法[49]、S曲線法[50]、OAV法[51]和σ-τ圖法[52]。

同時，一些研究已經試圖解決水果中香氣化合物之間的相互作用。陳佳瑩[53]通過S曲線法和σ-τ圖法對綠橙中香氣物質之間的相互作用進行研究，結果表明：在所有協同的混合物中，大多數二元混合物中的單一化合物一個是超閾值濃度水平和一個近似閾值濃度水平，同時說明不是只有OAV大于1的物質才是關鍵香氣物質，近似閾值濃度水平的香氣物質也會通過與其他香氣物質相互作用后對混合物的風味產生一定的影響。進一步的，王若琳[54]使用上述相同方法對刺梨中關鍵香韻(酸香、木香、果香、青香)之間的相互作用進行研究，結果顯示：果香和酸香、果香和青香、酸香和木香、酸香和青香的組合有加成作用效果，木香和青香組合為掩蓋作用效果。

酯類是蘋果中主要的揮發性物質，但是酯類之間的相互作用研究卻很少。在一項研究中[47]，作者首先篩選出紅蘋果果汁關鍵香氣化合物，并選擇4種化合物(2-甲基丁酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯)作為研究對象。利用S曲線法研究蘋果汁中化合物可能發生的相互作用。結果顯示，與不添加這4種揮發性化合物的溶液相比，添加后溶液的感官閾值降低，甜香、脂蠟香、果香和花香香韻的香氣強度增強，酸香香韻的香氣強度降低，以此推斷出這4種化合物與蘋果汁中其他香氣物質發生了相互作用。此外，研究還通過σ-τ圖法研究了添加單一化合物(2-甲基丁酸乙酯)后對香韻的影響，來進一步證實香氣化合物之間發生的相互作用。得出結論：當添加低于閾值濃度的揮發性化合物時，對原溶液化合物具有部分加成或協同作用。筆者研究團隊[55]也從蘋果汁的關鍵香氣物質中選擇了6種酯類物質，通過氣味閾值、香氣強度、電子鼻等方法來評估不同類型的酯類化合物之間的相互作用。對于某些具有相似結構和香氣的酯類化合物來說，得出它們之間可能發生加成或協同作用的結論。同時指出，不是所有具有相似結構和香氣的物質都符合這個結論，這也進一步證明香氣化合物之間復雜的相互作用。

揮發性含硫化合物廣泛存在于水果中，是水果中重要的香氣化合物，尤其在熱帶水果中，盡管含硫化合物的濃度很低，但因其閾值低，所以對香氣的貢獻很大。筆者研究團隊[56]從芒果中挑選了5種含硫化合物來研究相互作用，通過Feller添加模型、OAV和向量模型研究表明它們之間大多表現出掩蔽作用。

2.2 基質與香氣物質的相互作用

香氣協同研究解決了忽略OAV小于1的揮發性香氣物質對整體香氣的貢獻的問題，基質與香氣物質相互作用研究是為了檢驗OAV大于1的化合物是否對整體香氣有貢獻。

水果基質是由揮發性和非揮發性物質組成的復雜的多組分系統，除了香氣物質之間的相互作用，香氣物質與非揮發性基質組分的相互作用也會改變食品上方頂空的揮發度和濃度，這些頂空濃度的變化會導致感知香氣強度的差異。食物基質的組成會通過影響風味化合物的釋放，進而影響閾值。人們在嗅探食物時，香氣物質必須從食物基質中釋放到空氣中，然后穿過鼻腔到達嗅覺黏膜，香氣物質從食物基質中的釋放是鼻前和鼻后感知的起點。

雖然OAV考慮了香氣物質與基質的相互作用，但目前OAV的計算依賴于使用香氣物質在水基質中的閾值[57-59]，原因在于測量閾值的工作量較大且缺乏在其他食品基質中氣味閾值的測定結果參考，此外，水是無味的基質而大部分水果基質中都含有氣味，會影響閾值的測量。但是測量水中的氣味閾值并沒有考慮到食物基質中揮發性和非揮發性化合物之間可能發生的復雜相互作用。對于大多數水果中的揮發性物質，已經在水溶液中確定了氣味閾值，而在真實基質中的氣味閾值測定結果報道很少。

Plotto等[59]測定了橙汁中的萜烯和醛的鼻前閾值，比水中的閾值高15倍(檸檬酸、己醛)至200倍以上(β-蒎烯、檸檬烯)，同時測定了橙汁中酯類化合物的鼻前閾值[58]，可以比水中高2倍(丁酸甲酯)至30倍(丙酸乙酯)，這些在實質上都會影響OAV計算結果的準確性。不同類型果汁的香氣活性物質不同，并且香氣物質的閾值在不同基質中存在差異。所以，不應將一種食物基質中確定的閾值轉化到另一種食物系統中使用。當將某香氣物質的濃度與不適當的閾值進行比較時，可能導致食品中香氣物質的實際效力被低估或高估。

食物基質主要是由大分子組成的，如脂質、蛋白質、碳水化合物和多酚等。這些大分子與芳香化合物(小分子)發生特定的、有選擇性的相互作用來影響人們對芳香的感知。而對于另一部分較小的分子，例如單糖等，對某些揮發性化合物吸附或有“鹽析”作用[60]。

不同程度的相互作用影響，受香氣物質固有的理化性質[61](疏水性、親水性和揮發性)、基質的組成(性質、含量)、流變學性質[62]以及最終的環境條件(溫度、pH值)的影響。非揮發性化合物根據其分子質量或特定的化學性質可以改變芳香化合物在基質和氣相之間的分配，從而影響芳香化合物在鼻腔中的釋放[63]，進而影響消費者對食品的接受度。為了被感知，芳香化合物必須從食物基質轉移到氣相且高度依賴于它們與食物基質中存在的非揮發性化合物的相互作用。Bezman等[64]發現番茄基質減少了新鮮番茄關鍵特征香氣的釋放。

不同揮發性化合物及其濃度之間的平衡決定了水果及其產品的整體風味，而水果及副產品在加工過程中會改變特征性揮發性物質[65-66]，或改變質構，質構的改變對整體香氣會有影響。

糖作為小分子基質，對水果產品質量的影響已成為許多研究的主題。Pan等[67]研究了蔗糖，葡萄糖和果糖對新鮮芒果汁中活性香氣化合物釋放的影響，通過傅立葉變換紅外和等溫滴定熱分析表明：隨著糖含量增加，新鮮果汁中的香氣釋放會根據香氣物質的結構而改變且釋放變化主要是由熵驅動的。Baldwin等[68]使用除臭番茄泥評估了番茄的香氣發現：添加糖與各種香氣化合物相互作用通常會降低對青香的感知，同時增強與成熟，熱帶和番茄相關風味的感知。

目前基質與香氣化合物相互作用研究的文獻在水果及其產品體系下研究較少。多酚是水果中的重要化合物，能夠結合芳香化合物，其相互作用已在酒中進行大量研究。Guo等[69]研究了多酚對蘋果酒中香氣物質釋放的影響，酚類化合物濃度的增加顯著影響大多數芳香化合物的頭部空間濃度。研究發現：3種多酚導致大多數疏水香氣化合物的揮發性降低。

同時，Sabatini等[70]發現揮發性物質在橄欖果基質和鹽水培養基中的分配有很大不同。大多數揮發性物質對水果基質的親和力主要取決于分子的化學特性(鏈長和分支，極性或非極性基團等)，還取決于“鹽析”效應。

3 展 望

水果香氣物質分析一直受到行業的密切關注，分析儀器的進步及方法的擴展使得人們對水果香氣物質有了進一步的認識，但目前在提取水果揮發性香氣物質大多使用單一的方法，這使得不能夠全面富集物質，在前處理中應采用多種提取方式，互相參考分析結果使得結論更加準確。分析揮發性物質的貢獻時，不能忽略某些微量成分對整體香氣的關鍵作用，這使得提高痕量成分檢測技術的準確性、靈敏度至關重要，同時，僅分析單一因素(如成熟度)對水果香氣的影響，會缺乏對水果及其產品香氣的進一步認識，應將綜合因素相結合進行研究。

鍵合態香氣物質是水果重要的芳香潛力物質，但因工業提取成本高昂，阻礙了糖苷前體優化產品質量的能力。未來的研究應該提高對糖苷水解機制的理解，并提高量化能力。此外，還需要進行感官研究，以確定增加糖苷水解的步驟是否會對香氣產生顯著差異。同時，如何控制增香的強度，調控增香方向也是一個重要課題。

另外水果揮發性成分組成復雜，這些香氣成分與特定香氣之間具有復雜的相互作用，在研究水果揮發性成分在復雜基質中的行為時，目前研究人員僅以兩元或三元混合物為研究對象，并在理想體系下研究了不同濃度，配比條件下的閾值變化及其對香氣強度的影響，進而闡明了兩者之間可能的協同作用，沒有考慮在不同復雜基質下對香氣協同的影響。同時，在研究基質與香氣物質作用時大多使用模擬簡單的理想體系，而基于單個成分的結果并不能完全說明真實食品的香氣釋放情況，需要對模擬基質進行完善或使用真實基質。

此外，如何通過水果香氣分析調控風味、通過感知相互作用掩蔽水果加工產品異味物質，模擬水果風味在口腔中的釋放，鼻后香氣檢測及其相互感知作用也是未來水果香氣研究的重點。