肝細胞生長因子基因修飾的間充質干細胞治療肝損傷的研究進展

修文麗 毛成剛 楊晨宇 董蒨

肝損傷修復是指肝臟受到各種病理性因素（如感染、藥物、毒物、手術和外傷等）刺激后，肝臟細胞受到破壞，繼而機體啟動損傷修復機制的過程。在此過程中，肝內炎癥的過度反應、氧化應激、細胞過度凋亡和組織纖維化等，均可導致肝組織壞死、結構異常。嚴重者肝臟纖維結締組織繼續增生，假小葉形成，肝臟纖維化，進而發展為肝硬化，最終不可逆地走向肝衰竭[1]。盡管目前內科領域有各種保肝藥物的研發應用，外科領域有計算機輔助手術系統更加精準指導手術[2-3]，但減輕肝臟損傷、促進肝臟修復和再生、阻止肝纖維化始終是肝損傷治療研究中的難點和熱點。間充質干細胞（mesench ymal stem cells，MSCs）是一類能進行自我復制更新、具有分化為多種組織細胞潛能的干細胞，來源廣泛，是目前進行基因改造優選的明星干細胞。MSCs 可旁分泌多種細胞因子，肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）是其中重要的一種，可發揮促進肝細胞DNA 合成、有絲分裂、抑制凋亡，調節炎癥反應，促進血管再生，減輕組織纖維化等生物學效應。隨著近年來對MSCs 研究的愈加深入，發現HGF 基因修飾的MSCs（HGF-MSCs）對肝損傷的治療能夠發揮更大的效果，本文就此展開綜述。

一、MSCs

MSCs 是一種來源于胚胎發育早期的中胚層干細胞，擁有自我復制更新和多向分化潛能[4]。它廣泛分布于骨髓、臍帶和脂肪等多種組織和器官中。國際細胞治療組織（International Society for Cellular Therapy）對鑒定人的MSCs提出了以下3 點標準[5]：（1）在標準且適宜的培養條件下，必須貼壁生長；（2）細胞表面標志物表達CD105+/CD73+/CD90+，同時造血干細胞表面標志物 CD34、CD45、CD11a、CD19 和人類白細胞抗原-DR 等陰性表達；（3）在體外經特殊條件誘導，能分化為機體多種細胞（如成骨細胞、成軟骨細胞和成脂肪細胞等）。MSCs 除具有以上所述的生物學特性外，還具有來源途徑廣泛、類型多樣、表面抗原性弱、免疫原性低和致瘤性極低等優勢，從而使MSCs 具有廣闊的發展前景。

在肝臟研究方面，有學者發現不同組織來源的MSCs 不僅形態和表型相似，而且都具備向功能性肝細胞分化的潛能[6]。MSCs 移植入肝臟受損的動物或人體內，可定植于受損肝組織，分化為正常肝臟細胞并在一定程 度上取代受損細胞[7-8]，并且旁分泌大量細胞因子[9]，通過多種信號通路誘導肝細胞增殖，調節炎癥反應，促進血管再生，減輕纖維化[10-13]，從而為肝臟疾病開辟了新的治療思路和途徑。

隨著研究的深入，學者們發現移植后損傷部位的MSCs存活率低、分化效率低，單純依靠MSCs對肝損傷的治療作用有限。但是增加MSCs 的移植劑量可能會帶來栓塞和組織壞死等未知風險，因此基因修飾MSCs 為科學家們提供了新思路[6]。

二、HGF

1984年Nakamura 等[14]首次從部分肝切除術后的大鼠血清中分離到HGF，研究發現HGF 是一種具有促進增殖效應的細胞因子?？茖W家們進一步研究發現，（1）HGF 系由α鏈（69 kDa）和β 鏈（34 kDa）通過一對二硫鍵鏈接構成的異二聚體。α 鏈中有類似于纖溶酶原和凝血酶中的kringle 結構，β 鏈中有類似絲氨酸蛋白酶的催化結構域。HGF 的β 鏈蛋白序列還與擴散因子同源；（2）HGF 主要由肝臟間質細胞分泌，如肝星狀細胞、Kupff er 細 胞和血管內皮細胞等；（3）HGF 可與特異性跨膜受體c-Met 結合，激活細胞內信號轉導分子，繼而發揮HGF 的生物學效應。

HGF 是目前已知的促肝細胞有絲分裂最強的細胞因子，Mars 等[15]向無血清培養的原代肝細胞加入1 ng/mL 的外源性HGF，即可觀察到其顯著促進DNA 合成。除此之外，HGF還具有強有力的促進內皮細胞增殖和毛細血管管腔形成能力；抑制細胞凋亡的能力，減輕組織損傷；促遷移效應，能夠提高多種細胞的運動能力；高濃度條件下的腫瘤抑制效應，抑制某些癌和肉瘤細胞系的生長[16-19]。

盡管HGF 具有如上眾多的正面效應，但是HGF 的臨床應用仍然有很多限制：（1）HGF 生理分泌量少，難以分離、富集和純化；（2）HGF 是大分子的糖基化蛋白，在血液中半衰期短，需要反復注射才能達到有效血藥濃度；（3）運輸和保存困難；（4）致癌、促癌轉移和誘導耐藥等負面效應[20-21]；（5）肝外器官的血液大量分流，直接影響了外源性HGF 對肝損傷的治療效果[17]。

三、HGF-MSCs 治療肝損傷

HGF 是MSCs 分泌的發揮生物學效應的主要細胞因子之一[22]。王榮等[23]研究發現，體外多次傳代培養的人臍帶間充質干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hucMSCs）均可分泌細胞因子HGF，但分泌的HGF 量很少且隨著MSCs 傳代次數的增加而降低。加上MSCs 在損傷部位存活能力低下，嚴重影響MSCs 治療效率。近年來，隨著基因修飾技術的發展，針對HGF 基因修飾MSCs 獲得的HGF- MSCs 的研究越來越多，學者們也逐漸發現HGF-MSCs對于肝損傷修復可能有更好的治療效果（圖1）[24-52]。

（一）抑制凋亡

圖1 HGF-MSC 治療肝損傷

Zhang 等[24]在研究過表達HGF 的脂肪間充質干細胞（adipose mesenchymal stem cells，ADSCs）對放射線誘發的肝損傷大鼠的治療作用中發現，HGF-ADSCs 治療組染色質濃縮明顯逆轉，肝細胞凋亡明顯減少，肝細胞再生相較于ADSCs 治療組更顯著。Jang 等[25]在研究HGF-MSCs 減輕對乙酰氨基酚誘導的肝細胞損傷中發現，HGF-MSCs 上清液處理的肝細胞活力增加，抗凋亡蛋白（Mcl-1）表達增加，促凋亡蛋白（Bad，Bik 和Bid）表達降低。Yu 等[26]將HGF-MSCs經門靜脈注射至小體積肝移植術后（移植百分比為30%）的大鼠體內，結果發現大鼠死亡率下降，肝再生增強；同時HGF及其受體c-Met 的表達量增加，且與肝再生呈正相關關系。同樣另有研究發現，當HGF/c-Met 信號途徑中斷時，再生肝臟的體積較小并且表現出廣泛的肝細胞死亡[27]。另外，過量表達的HGF 還可以抑制MSCs 的凋亡。Choi 等[28]在研究過表達HGF 對過氧化氫（H2O2）誘導的MSCs 保護作用時發現，HGF-MSCs 內凋亡相關蛋白減少，凋亡細胞的數量下降，細胞活力提高了1.68倍。以上研究提示HGF-MSCs 通過增強HGF/c-Met 途徑，發揮更顯著的抑制肝細胞凋亡和保護MSCs 作用，提高MSCs 治療效率，最終促進肝再生。

（二）誘導MSCs 向肝樣細胞分化

HGF 是誘導MSCs 向功能性肝細胞分化重要且有效因子之一[22]。無論是HGF-MSCs 還是在MSCs 中加入外源性的HGF[29]，MSCs 均可分化為功能性肝細胞。HGF 與其他細胞因子（胰島素樣生長因子1、白細胞介素1β 等）聯合誘導可提高MSCs 分化的效率和質量[30-31]。由于HGF 是誘導分化的關鍵因子，因此HGF-MSCs 可能更有利于誘導MSCs 分化為肝樣細胞，從而提高MSCs 的替代治療效果。

（三）降低氧化應激

氧化應激是指在某些病理狀態下，機體內氧化與抗氧化的動態平衡失衡，導致細胞死亡和組織損傷的過程[32]。Moon 等[33]將HGF-MSCs 移植到二甲基亞硝胺誘導的肝纖維化大鼠中發現，H2O2誘導肝細胞的毒性降低，肝細胞內活性氧種類減少，促凋亡蛋白和肝細胞凋亡減少。Choi 等[28]在H2O2誘導的HGF-MSCs 中發現，HGF 的過量表達使細胞內活性氧水平減少了27%，細胞活力明顯增加，提示HGFMSCs 可增強MSCs 抗氧化能力。因此HGF- MSCs 在治療肝損傷的過程中，可通過降低氧化應激抑制凋亡，而損傷局部MSCs 的存活數量的增加，將發揮更大的移植效果。

（四）免疫調節

MSCs 通過分泌HGF 減輕免疫反應，或使受體處于免疫耐受狀態來調控炎癥反應，從而減輕肝臟損傷[34]。MSCs 來源HGF 可抑制單核細胞發育成熟為樹突狀細胞[35]，可有效抑制CD4+及CD8+T細胞增生[36]。Bian 等[37]研究顯示，過表達HGF 的骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）在體外混合淋巴反應中仍維持BMSCs原本的增殖和分化能力，但明顯抑制了異常淋巴細胞增殖，并且對體外的細胞免疫具有更強的抑制效果。他們后續的實驗發現HGF-BMSCs 和未經轉染的BMSCs 免疫抑制功能相似，但HGF-BMSCs 針對部分免疫細胞（如NIH3T3 和CD11b+/-細胞等）具有更強的免疫調節作用。朱金海等[38]研究發現，HGF-BMSCs 注射與單獨BMSCs 注射相比，更加顯著減輕急性移植物抗宿主病中的急性排斥反應，并且大幅度延長受者的生存時間。由此可見，HGF 基因修飾明顯增強了MSCs 的免疫抑制功能，更有效地減輕免疫排斥反應。

（五）抑制內皮細胞凋亡、促進血管新生

各種病理性刺激因素、炎癥、氧化應激等在造成肝細胞損傷的同時，往往也造成血管結構破壞。肝內缺血不僅加劇肝損傷，而且不利于肝臟損傷修復，因此減輕血管損傷或者促進血管重建在肝損傷修復中具有重要意義。劉滋康 等[39]通過結扎大鼠股動脈來模 擬局部肢體缺血，并且以它為模型研究HGF-BMSCs 在體內促血管新生效應時發現，HGF-BMSCs組血流灌注水平明顯高于MSCs組，而且HGF- BMSCs 與MSCs 相比，內皮細胞促增殖、促遷移及重建血管結構等效應更顯著。Su 等[40]也有相似的發現，即HGFMSCs組毛細血管密度最高，提示這可能與HGF-MSCs 誘導更強的血管新生效應密切相關。陳安平等[41]研究HGFBMSCs 改善慢性缺血心肌時發現，缺血區血管生成顯著增加，從而改善了心肌缺氧微環境。因此在肝臟損傷時，MSCs旁分泌的HGF 可能也存在以上機制抑制血管內皮細胞凋亡，促進肝臟新生血管的形成，從而改善肝臟缺血，而HGFBMSCs 可能增強了這種效應。

（六）抗纖維化

肝纖維化是慢性肝病發展為肝硬化的中間環節，逆轉肝纖維化是防止肝衰竭的關鍵階段。目前普遍認為，肝纖維化進展的首要因素和中心環節是肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）的激活。在肝細胞損傷、炎癥等始動因素作用下，HSCs 被激活，轉變為肌成纖維細胞并產生大量細 胞外基質[42]，基質重塑，最終導致肝纖維化。因此促進HSCs 的凋亡、減少基質重塑可能是逆轉肝纖維化的重要途徑[43]。以往的研究表明，在肝硬化大鼠模型中應用外源性HGF 或單獨移植MSCs 均可減輕肝臟纖維化[44]，其原因可能與抑制HSCs 的激活和減少膠原在肝臟沉積有關[45]，HGF-MSCs 增強了這些效應[46]。

1.誘導及促進HSCs 的凋亡：目前認為HSCs 的凋亡水平同肝纖維化的逆轉程度基本一致[42]。Kim 等[47]研究報道慢性肝損傷時發現，HGF 可能通過JNK 磷酸化促進活化的HSCs 凋亡。蘇思標等[48]發現MSCs 抑制HSCs 增殖的機制可能與RhoA-P27通路使HSCs細胞周期停滯有關。隨后學者們發現MSCs 發揮HSCs 的促凋亡作用可能與HGF有關[49]，作用于神經生長因子P75 信號通路、Fas/FasL通路等逆轉肝纖維化[50]。HGF-MSCs 也可能從以上途徑促進HSCs 的凋亡，甚至發揮更好的效果。

2.減少基質重塑：當肝組織受損時，HSCs 被激活，轉化為肌成纖維細胞，同時基質和膠原合成增加，降解減少，合成和降解平衡被打破，導致基質重塑和肝臟纖維化[43]。Yu等[51]在研究減輕小體積肝移植大鼠模型中缺血再灌注和慢性損傷時發現，HGF-MSCs 明顯抑制小體積肝移植大鼠肝纖維化的形成，從而促進肝再生，降低大鼠死亡率；在這一過程中，HGF-MSCs 的抗纖維化作用不僅與調節HSCs 活化和凋亡有關，還與顯著減輕膠原的沉積有關。Pulavendran 等[52]也發現HGF-BMSCs 可使Ⅰ型膠原明顯減少，細胞外基質纖維溶解，進而逆轉肝纖維化。Zhang 等[24]在研究改善輻射誘導的肝纖維化過程中發現，HGF-ADSCs 可能通過下調α-平滑肌肌動蛋白和纖維連接蛋白等，減少基質重塑。

綜上所述，HGF-MSCs 不僅不會影響MSCs 原有的干細胞生物學特性，而且與單純的MSCs 或HGF 移植相比對肝損傷有明顯優勢。HGF-MSCs 中過量表達的HGF 對MSCs抗氧化和抗凋亡的保護作用，解決了移植區MSCs 高凋亡率問題。HGF-MSCs 作為HGF 基因的細胞載體在損傷部位增加HGF 的分泌[53]，解除了HGF 的臨床應用部分限制。因此HGF-MSCs 移植在肝損傷修復中充分發揮了MSCs 和HGF優勢，彌補它們在臨床應用上的部分劣勢，發揮 “1+1＞2”的治療效果[54]。

四、問題和展望

上述眾多的體內外實驗和臨床試驗均展示MSCs 在促進肝細胞再生和修復方面具有廣闊的前景，同時也證實了MSCs 的安全性，未發現致瘤性。但HGF-MSCs 能夠高表達HGF，HGF 的配體c-Met 在腫瘤中也是高表達，因此HGF- MSCs 是否在致瘤方面有更大的風險，HGF-MSCs 能否精準高效地調控HGF 分泌等還有待進一步研究。相信隨著干細胞研究技術的進一步成熟，一定能夠給肝病患者帶來新的曙光。