Genistein通過上調Cyclin D1和CDK4的表達促進卵巢癌OVCAR-5細胞的增殖

李 雯，李 毅，王中衛，任洪濤，張 楊，楊鵬濤，潘淑沛，王亞利

(西安交通大學第二附屬醫院腫瘤放療科，陜西西安 710004)

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，其死亡率居婦科惡性腫瘤之首。由于卵巢癌發病隱匿且缺乏有效篩查手段，70%的患者就診時已處于晚期。即使行腫瘤細胞減滅術和化療，70%的患者仍會復發。并且每次治療后，大部分患者的復發周期會逐步縮短并產生耐藥性。

早期研究認為持續排卵后傷口愈合引起的細胞增殖過快和促性腺激素刺激可能是卵巢癌的發病機制[1-3]。之后的研究表明卵巢癌的病因要復雜得多。雌激素受體激活，活性氧(ROS)水平升高和NF-κB介導的炎癥可能都是卵巢癌發病機制之一[4-6]。植物雌激素不僅有弱的雌激素活性，而且有清除自由基、抗炎等作用，這些機制可能有助于其影響癌癥的進展。攝入含有植物雌激素的食物可以降低卵巢癌的發病率[7]。Genistein是廣泛存在于食物和中草藥特別是大豆類食物中植物雌激素的一種主要類型，對β雌激素受體有高度親和力，可以通過多重機制發揮抗癌作用[8]。研究發現，Genistein可以誘導有抗炎作用的谷胱甘肽過氧化物酶的表達，以及抑制前列腺癌細胞株LINCaP和PC-3的增殖[9]。

植物雌激素和卵巢癌流行病學相關性研究尚存爭議[10-13]。BANDERA等[14]通過一項病例對照研究分析食物或補品中植物雌激素的攝入和卵巢癌罹患風險的關系，尚未發現兩者之間存在相關性。然而，QU等[15]納入10個觀察性研究的Meta分析結果發現，植物雌激素的高攝入和卵巢癌罹患風險的降低是有關的；亞群分析表明異黃烷酮、大豆食品及亞洲飲食方式能夠降低卵巢癌的發病率。因此，卵巢癌細胞中植物雌激素的生物活性值得進一步的研究。

本研究分析了Genistein對卵巢癌細胞株OVCAR-5細胞增殖的影響，并明確了細胞生長、活性和關鍵細胞周期調節因子的表達。研究結果可為深入分析Genistein在卵巢癌細胞中的作用和機制提供基礎信息。

1 材料與方法

1.1 細胞培養卵巢癌細胞株OVCAR-5細胞培養于RPMI-1640培養基，含100 mL/L胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素，在37 ℃的50 mL/L CO2環境下培養。

1.2 材料Genistein購自德國Merck KGaA公司?？贵w的稀釋倍數、目錄號和來源分別是：①抗增殖細胞核抗原小鼠抗體1∶1 000 Cat. No. SC-56, Santa Cruz Biotechnology, Inc. Dallas, Texas, USA。②抗CDK4兔子多克隆抗體，1∶1 000 Cat. No. ab108357, Abcam Cambridge, MA, USA。③抗Cyclin D1多克隆抗體，1∶1 000 Cat. No. ab40754, Abcam Cambridge, MA, USA。④抗蛋白p21小鼠單克隆抗體，1∶1 000 Cat. No.SC-397, Santa Cruz Biotechnology, Inc. Dallas, Texas, USA。⑤抗蛋白p27兔子多克隆抗體，1∶1 000 Cat. No.3686S, Cell Signaling, Danvers, MA, USA。⑥抗β肌動蛋白小鼠單克隆抗體，1∶1 000，Cat. No.EG-262, 1∶1 000；Excellgen, Rockville, MD, USA。⑦二抗，抗兔子IgG-HRP Cat. No.SC-2301, Santa Cruz Biotechnology, Inc. Dallas, Texas, USA。⑧二抗，山羊抗小鼠IgG-HRP Cat. No.G21040, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA。

1.3 方法

1.3.1細胞計數和MTS檢測 將OVCAR-5細胞接種在96孔培養板，用1 μmol/L的Genistein處理后，每隔24 h記1次細胞數。在每個時間點，通過胰蛋白酶-乙二胺四乙酸的消化作用收集細胞。用4 g/L的臺盼藍(錐蟲藍)溶液混合懸浮的細胞，并用血細胞儀進行細胞計數。對于MTS法細胞活性實驗，用1 μmol/L的Genistein處理，在每個時間點，把20 μL含有MTS[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲酯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑]細胞滴度為96的水溶液(Cat.No.G5430, Promega, Madison, WI, USA)加入培養基中。1 h后，將100 μL的培養基從培養板中移開，并用96孔讀板儀(Modulus Microplate Multimode Reader, Turner BioSystems, USA)測量490 nm處的吸光度。

1.3.2BrdU聯合檢測免疫組化實驗 用1 μmol/L Genistein(終濃度)處理OVCAR-5細胞48 h。將5-溴-2′-脫氧尿苷(BrdU) (Cat. No.000103; Invitrogen, Rockville, MD, USA)加入細胞培養基中，用2 h和基因組DNA整合。用冰冷PBS洗滌后，用700 mL/L的乙醇在4 ℃下固定細胞3 h，并用2 mL/L的Triton X-100滲透30 min。按制造商的指示使用BrdU試劑盒(Cat. No.933943; Invitrogen)進行BrdU抗體結合和顯色。對BrdU陽性的細胞和所有細胞進行計數，計算出BrdU的陽性率。

1.3.3RNA提取和實時PCR 用1 μmol/L Genistein對OVCAR-5細胞處理48 h后，經冰冷PBS洗滌，再用RNeasy超迷你試劑盒(Cat.No.74136，QIAGEN, Valencia, CA, USA)提取出全部RNA。用1 000的分光光度計(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)測量RNA濃度。在高容量RNA-to-cDNA試劑盒(Cat. No.4387406, Applied Biosystems, Foster, CA, USA)中，用1 μg RNA合成cDNA。用Primer3程序(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)設計實時PCR引物(表1)。用ABI 7900HT快速實時PCR儀(Applied Biosystems, Dublin, Ireland)做定量實時PCR。每個實時PCR反應體系：6 μL實時PCR反應混合物(Cat. No.75600, VeriQuest SYBR-Green master mix, Affymetrix, Cleveland, OH, USA)，2 μL 1∶100稀釋的cDNA，1 μL正向、反向引物(10 μm)以及2 μL ddH2O。95 ℃變性10 min；40個循環擴增：95 ℃變性15 s；60 ℃退火30 s；72 ℃擴增1 min。GAPDH作為內參基因，以使結果標準化。解鏈曲線分析證實了目標cDNA的特異性擴增。用GAPDH水平使目標RNA相關RNA的表達水平標準化。

表1 實時PCR引物Tab.1 The Real-time PCR primers

1.3.4Western blotting檢測 用1 μmol/L Genistein處理OVCAR-5細胞48 h。經冰冷PBS(pH 7.4)洗滌2次，用冰冷裂解緩沖液[150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-鹽酸(pH 7.4)，0.1% SDS，0.5%脫氧膽酸鈉，1%諾乃清潔劑P-40]在冰上裂解，并用1% Halt蛋白酶抑制劑混合物(100×; Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)、1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)、5 mmol/L氟化鈉(NaF)及1 mmol/L釩酸鈉(Na3VO4)補充。收集細胞裂解物，并在4 ℃離心30 min(1 400 r/min)。將35 mg蛋白和SDS上樣緩沖液混合，煮沸5 min，根據目標蛋白相對分子量于8%～12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠中溶解分離。將蛋白轉移到PVDF膜上，含有50 g/L脫脂牛奶和0.1% Tween-20的TBS用于阻止非特異性結合。在主要抗體結合、廣泛洗滌和第二抗體結合后，用ECL系統(Cat. No.32106, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)進行顯色。剝離膜和檢測肌動蛋白以提供蛋白負荷控制。

2 結 果

2.1 Genistein促進了OVCAR-5細胞的增殖與活性為了檢測染料木黃酮對細胞生長的影響，用1 μmol/L Genistein處理OVCAR-5細胞，每日細胞計數(圖1)。與對照組相比，Genistein處理細胞3 d后，細胞數量顯著增多。MTS法實驗結果與之一致，經處理4 d后，各時間點的細胞活性顯著增加(圖2)。這表明Genistein能夠促進OVCAR-5細胞的增殖和活性。

圖1 細胞增殖實驗結果

圖2 測量細胞活性的MTS實驗結果

2.2 Genistein促進細胞DNA合成用BrdU免疫組化實驗檢測Genistein對DNA合成的影響。在處理3d后對陽性細胞和所有細胞計數，得到陽性率(圖3)，和對照組相比，實驗組的BrdU免疫組化染色增加，表明DNA合成上調。該結果與之前實驗中Genistein促進細胞增殖與活性的結果一致。

圖3 BrdU免疫組化染色分析實驗結果

2.3 Genistein引起細胞周期調節因子mRNA水平變化基于上述Genistein對細胞作用的實驗結果，實時PCR測定PCNA、Cyclin D1、CDK4、p21及p27的mRNA表達(圖4)。PCNA是DNA合成所需要的，經常被用作細胞周期進展的標記。Cyclin D1和CDK4是G1-S期轉變所需的細胞周期調節因子。P21和p27是細胞周期進程的負調控因子。Genistein處理2 d后的結果表明PCNA、Cyclin D1和CDK4的mRNA水平明顯上調，p21和p27的mRNA水平顯著下降。表明Genistein對OVCAR-5細胞G1-S期的轉變有強正性作用。

2.4 Genistein引起細胞周期調節因子蛋白水平變化為了明確上述細胞周期調節因子蛋白水平上的變化，對Genistein未處理和處理48 h的細胞中分離出的總蛋白進行蛋白印跡分析(圖5)。用來自相應LCs的值進行密度分析和使結果標準化。結果顯示PCNA、Cyclin D1和CDK4的蛋白水平顯著增高，p21和p27蛋白表達下降。表明Genistein對OVCAR-5細胞的作用之一是促進細胞周期進程。

圖4 細胞周期調節因子mRNA水平變化

圖5 細胞周期調節因子的蛋白表達變化

3 討 論

為了評估Genistein對卵巢癌細胞增殖的影響，本研究在用Genistein處理OVCAR-5細胞后行細胞計數和MTS檢測，結果均表現為Genistein促進細胞增殖和DNA合成。為了證實Genistein對細胞周期進程的作用，檢測了多個細胞周期活化因子和抑制因子mRNA水平和蛋白表達水平的變化。CDK4(細胞周期蛋白依賴性激酶4)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，使視網膜細胞瘤(RB)基因產物和Smad3的磷酸化，促進G1-S期轉變[16]。Cyclin D1是細胞周期蛋白家族中的一員，可以與幾個CDKs組成復合體，使重要的細胞周期調節因子磷酸化。PCNA在DNA雙鏈周圍起支架作用，在DNA復制過程中促進DNA聚合酶及其他因子的募集。PCNA的水平反映細胞周期的正性進程[17]。p21是強效的CDKI(細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子)，通過結合細胞周期蛋白如CDK1和CDK2下調G1-S期的轉變。相似地，p27阻止CDK2和CDK4的活化以減緩細胞周期進程[16,18]。本研究發現這些細胞因子mRNA和蛋白表達變化趨勢一致。CDK4、Cyclin D1和PCNA等活化因子的水平增加，p21和p27等抑制因子的水平降低，表明Genistein促進細胞增殖很可能是通過促進G1-S期轉變所實現的。

文獻檢索發現大量關于植物雌激素對癌細胞作用的研究，但觀察結果存在爭議。大多數使用來自乳腺、大腸和前列腺等惡性腫瘤細胞株的研究表明Genistein能夠抑制癌細胞的增殖[11-12]。與之相反的是CHEN等[19]觀察到在寬范圍濃度(0.001～1 μmol/L)內的Genistein以劑量依賴的方式刺激Hela細胞的增殖。用Genistein處理Hela細胞組織引起細胞的S期增加、G1期減少，表明Genistein可能促進G1-S期轉變。而且，Genistein處理后細胞凋亡減少、Αkt和ΝF-κB活化。因此推斷Genistein可能通過雌激素受體介導的PPI3K/Akt/ΝF-κB通路促進Hela細胞增殖[19]。LUCKI等[20]得到了相似結果，他們發現Genistein通過誘導酸性神經酰胺酶的表達刺激MCF-7乳腺癌細胞生長。Genistein對癌細胞作用的差異可能是由不同的細胞因子引起的。首先，ERα或者ERβ的活化可引起不同的細胞應答，ERα活化有刺激作用，ERβ活化有抑制作用。因此最終的細胞應答取決于兩種ER在不同細胞或組織中的比例。第二，低濃度Genistein與ERβ結合，高濃度Genistein與ERα、ERβ均結合，細胞效應將相應變化為抑制或刺激[21]。第三，當培養基沒有雌二醇或其他更強的雌激素化合物時，Genistein弱的雌激素效應將表現出來。但是當實驗體系包含相當高水平的雌二醇或者其他強的雌激素化合物時，Genistein將和這些強雌激素化合物競爭并表現為抑制作用。雖然一些研究強調要清除培養基和血清中預先存在的雌激素，但是其他研究只用了含有酚紅的培養基和含有雌激素的血清，這可能會對最終觀察到的結果產生影響。第四，通過雌激素受體或其他通路介導的表觀遺傳機制，可能有助于Genistein作用產生[22]。RIETJENS等[23]提出一個二次元模式，可以解釋關于異黃酮對細胞增殖看似矛盾的作用。除了ER介導的反應外，異黃酮可能也通過一些尚未解釋清楚的機制影響DNA甲基化、組蛋白修飾和miRNA的表達模式。

本研究用無酚紅培養基和無雌激素培養基進行細胞培養，這可能部分解釋了Genistein在無雌激素環境下的雌激素效應。重要的是，上述結論可能也適用于活體環境，并可能釋了為什么會從年齡、絕經狀態或BMI(已知影響內源性雌激素水平的因素)等不同人群的流行病學研究中獲得不一致的結果。在活體內Genistein對癌癥發展的影響可能會受到其他因素如腫瘤免疫、微環境及細胞間相互作用等的影響。即使Genistein的攝入對卵巢癌的發生有預防作用，也不一定是由其直接抑制細胞增殖引起的。從這個角度看，需要在雌激素化合物的背景水平下進行更全面的研究，以確定Genistein對癌細胞的確切作用。

綜上所述，本研究評價了廣泛存在于食物和中草藥中植物雌激素的主要類型——Genistein在無雌激素環境中對卵巢癌OVCAR-5細胞的細胞增殖作用。結果表明Genistein能明顯促進卵巢癌細胞增殖。此外，Genistein作用細胞可引起多個細胞周期調節因子和標志物表達的改變。這些發現豐富了目前對植物雌激素生物活性的認識，并將促進今后對其潛在分子機制的研究。