寇氏隱甲藻生產DHA的研究進展

楊曉輝,賈曉強

(天津大學 化工學院 系統生物工程教育部重點實驗室，天津 300354)

脂肪酸是由烴鏈和羧基組成的有機化合物，多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid，PUFA)是其中的一類[1]。多不飽和脂肪酸中的二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA，C22∶6)在預防心血管疾病、炎癥、自身免疫性疾病等方面發揮著重要作用[2]。以往獲取DHA的傳統來源是深海魚油[3]，然而，這些來源的DHA具有魚腥味重、穩定性差的問題[4]。研究表明，海洋魚類中DHA的積累主要來源于微藻，因此，可以開發利用生產DHA的微藻的技術來實現DHA的微生物生產[5]。

海洋微生物細胞中含有大量的DHA，且被認為是生產這種重要脂肪酸的潛在微生物來源。異養非光合微藻——寇氏隱甲藻(Cryptheccodiniumcohnii)可積累較高比例的脂質(約為細胞干重的40%)和高質量的DHA，近年來備受關注[6-8]，且因其產生的脂質中，其他多不飽和脂肪酸(PUFA)的含量相對于DHA的含量來說非常少，故非常有利于后期DHA的純化。但與許多其他微藻一樣，脂質積累效率和生物量是阻礙其工業化生產的兩個限制因素[9]。

為了解決這些問題，已有多種方法被報道，包括誘變育種[10]、發酵條件的優化[11-12]，尋找最適氮源等[13-14]。但在這些努力下，隱甲藻的脂質產量依舊低于其他的產油微生物[15-16]。與此同時，利用基因工程方法提高藻類微生物的脂質含量及生物量也被廣泛研究，又因為缺乏全基因組序列信息，限制了這種方法的深入應用。因此，研發DHA生產水平較高的工程藻株，探索高產DHA的發酵技術具有重要的經濟意義。

1 隱甲藻概況及其DHA的合成途徑

寇氏隱甲藻(C.cohnii)是有鞭毛的異養海生甲藻，形態多樣，一般為單細胞。它作為單細胞真核微生物，既可以進行無性繁殖，也可以進行有性繁殖。圖1(a)為Parrow等[17]通過掃描電鏡得到的隱甲藻電子顯微鏡照片，圖1(b)為本實驗室活化培養的隱甲藻ATCC 30772的普通光學顯微鏡照片。

圖1 電子顯微鏡和普通光學顯微鏡下的隱甲藻Fig.1 Crypthecodinium cohnii observed in electron microscope and optical microscope

目前，已發現的可以生產DHA 的海洋菌大部分是低級藻狀菌，在這其中研究比較多的有兩種，分別是破囊壺菌和裂殖壺菌[18-19]。具有DHA生產能力的微藻種類繁多且常見的是甲藻，如C.cohnii?？苁想[甲藻有較高的DHA生產能力，見表1，且在其產生的脂質中，其他多不飽和脂肪酸(PUFA)的含量相對DHA的含量來說非常少，含量低于 1%，這非常有利于后期的DHA純化。由于人們對醫藥或食品原料的要求非常高，而且多不飽和脂肪酸容易被降解或氧化，所以分離與純化的過程在微生物生產 DHA 的過程中非常關鍵。C.cohnii因其PUFA含量較少的特點使它成為眾多DHA生產藻中的優勢藻株[20]。

表1 不同微生物中DHA的百分含量的比較Table 1 Comparison of percentages of DHA in the lipids of different microorganisms

隱甲藻中ω-3多不飽和脂肪酸和DHA的總含量超過了30%，但是，隱甲藻中DHA詳細的合成途徑目前仍是不明確的。

1.1 FAS途徑

根據以往研究，人們通常認為 DHA 的合成最開始是利用長鏈不飽和脂肪酸作為底物的，然后再在細胞質內的微粒體中進行合成，之后再通過一系列的碳鏈延伸及去飽和過程獲得，這種途徑被稱為脂肪酸合成(Fatty Acid Synthesis，FAS)途徑[21]，見圖2[22]。

圖2 脂肪酸合成途徑及碳鏈延伸/去飽和途徑[27]Fig.2 Fatty acid synthesis(FAS)pathway and carbon chain elongation /desaturation pathway

然而對于通過該途徑合成DHA的合理性還存在很大爭議，主要問題在于Δ4去飽和酶(Δ4 Desaturase，Δ4 Des)是否存在于該途徑中，因為人們在較長一段時間內很難在DHA的合成過程中表征Δ4去飽和酶的活性，它的存在只是一個假設[23]。Qiu等[24]通過把破囊壺菌(Thraustochytrium sp.)中編碼Δ4去飽和酶的兩段cDNA(Fad4和Fad5)在釀酒酵母中表達，證實了Δ4去飽和酶參與破囊壺菌中DHA的合成，但是Δ4去飽和酶在寇氏隱甲藻中的作用機制還未有詳細報道。Beach等[25]用14C標記的乙酸鹽和辛酸鹽培養隱甲藻時，在所有的脂肪酸中都可以檢測到同位素，而當用14C標記的C10-C18脂肪酸(十八碳一烯酸(18∶1)和二十二碳六烯酸(22∶6)合成的前體物質)培養隱甲藻時，只有(18∶1)中檢測到同位素，而在(22∶6)中沒有檢測到。Sonnenborn 和 Kunau[26]則認為隱甲藻中的 FAS 途徑為 DHA 的合成提供了前體物質。

1.2 PKS途徑

James等[27]在裂殖壺菌細胞中發現了DHA合成的另一條途徑，稱為聚酮合酶合成(Polyketide Synthases，PKS)途徑。迄今為止，已鑒定的所有多不飽和脂肪酸合成酶都是分子結構極大的多功能酶復合物，由三至四個亞基組成。每個亞基可能含有多個結構域，如丙二酰輔酶A：ACP?；D移酶(MAT)，?；d體蛋白(ACP)，3-酮?；厦?KS)，3-酮脂酰-ACP還原酶(KR)，?；D移酶(AT)，鏈長度因子(CLF)，烯酰還原酶(ER)和3-羥基?；?ACP脫水酶(DH)。結構域的數量，位置和順序都決定了從酶復合物中釋放的最終代謝產物。Fisch等和Liu等進行了PKS酶的合理結構域交換，成功改變了其產物的鏈長并有效地產生了新的聚酮化合物，見圖3。Ratledge[28]認為隱甲藻類似于裂殖壺菌，也利用 PKS 途徑合成 DHA，且是隱甲藻中其他多不飽和脂肪酸產生的唯一途徑。

但是由于目前隱甲藻沒有完整的基因組信息，利用基因信息使用分子操作對其進行改造實現高產的研究十分受限。因此目前對隱甲藻產DHA的研究，大多是通過外界宏觀培養條件和發酵條件的改變使DHA產量提高，并利用代謝組學手段分析引起產量提高的內在機制，繼而通過理性改造相關基因實現DHA產量的提高。在下一節的隱甲藻高產DHA的理性設計和改造研究中將進行相關敘述。

圖3 聚酮合酶合成途徑Fig.3 Polyketide synthese(PKS)pathway

2 隱甲藻高產DHA的理性優化和改造研究

代謝組學(Metabolomic)的概念早在1999年由Nicholson提出，通過代謝組學手段的分析我們可以確定代謝途徑中的關鍵節點，并對相關代謝路徑進行優化和調節。

通過對常見的外界宏觀條件的改變，如碳氮源、pH、溫度、溶氧水平和化學誘導劑；利用代謝組學分析得到的結果在分子水平上對相關輔酶進行調節和基因進行改造以及發酵法生產DHA，綜合敘述通過理性優化和改造提高隱甲藻DHA產量的研究進展。

2.1 碳氮源、pH和溫度

人們研究發現，寇氏隱甲藻可以在營養豐富的海水中具備非常好的生長能力，可以達到很高的生物量。后來的研究人們又注意到寇氏隱甲藻可以利用的碳源的種類非常多，例如葡萄糖、乙酸和乙醇等[29-30]。研究表明，寇氏隱甲藻對自身所處的培養環境非常敏感，且細胞內的脂肪酸組成更是會受培養條件的影響而產生明顯變化?？苁想[甲藻生長的基本培養基中的初始葡萄糖濃度為9 g/L，Li等[31]通過實驗室馴化得到了一株高葡萄糖濃度耐受的隱甲藻，耐受葡萄糖濃度達到54 g/L，但馴化株在45 g/L葡萄糖濃度下油脂產量最高。利用加權關聯網絡代謝數據分析模型(WGCNA)對所得數據進行分析，認為谷氨酸、甘油、丙二酸和琥珀酸是和馴化株高度相關的核心化合物。Waseem等研究了不同氮源[(NH4)2SO4,(NH2)2CO,NH4HCO3和NaNO3]及其濃度對隱甲藻生產DHA的影響。結果表明，0.8 g/L的NaNO3作氮源能夠獲得較高的DHA產量，且認為檸檬酸裂解酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、蘋果酸酶、NADP和NAD+對N有顯著的響應。陳峰等[32]發現隱甲藻細胞生長及DHA積累的最適pH在6.0～7.5 之間；當pH低于3.96或高于9.75時，細胞基本不發生生長，處于被抑制的狀態。但pH在5.5～8.0之間時，pH對菌體生長與脂質的生產影響不大。郭小婧等[33]研究了隱甲藻在15,20,22,25,28 ℃下條件下以搖瓶發酵培養方式獲得的最大生物產量和最高DHA產量，結果表明，最適溫度為 22 ℃，由此獲得的生物產量為234.85 mg/(L·d)，DHA產量為17.45 mg/(L·d)，DHA含量為74.36 mg/g 菌體。

2.2 不同溶氧水平和化學誘導劑

氧的供應在隱甲藻生產DHA的發酵期間是非常重要的外界因素。然而，關于溶解氧(Dissolved Oxygen,DO)與細胞代謝之間的內在相關性研究報道很少。Diao等[34]評估了隱甲藻對不同DO水平的反應，表明在高供氧條件下，隱甲藻的生長速率和對葡萄糖的消耗速率要高得多。此外，基于GC-MS的比較代謝組學分析用于區分與不同DO水平相關的響應代謝物的結果表明，在指數期高DO水平下，參與糖酵解途徑和TCA循環的中間代謝物上調。在穩定期，在高DO水平下，涉及三?；视痛x的代謝物被上調，而OPP途徑的中間產物核糖-5-磷酸被下調。

Bose等[35]的研究表明，多種化學分子可用于增強脂質的積累，包括來源于生長素、細胞分裂素、赤霉素、信號轉導物和胺等的化學物質。為了明確這些化學誘導劑增強DHA生產的效果和機制，Li等[36]研究了來自生長素、赤霉素、細胞分裂素、信號轉導物和胺的化學誘導劑對隱甲藻中脂質積累的影響。結果表明，萘氧基乙酸(BNOA)、2-氯二十二酸、水楊酸(SA)、脫落酸(ABA)和乙醇胺(ETA)使隱甲藻中的脂質積累增加了10.00%～18.78%。此外，采用靶向代謝組學方法來解釋導致脂質積累增加的機制，結果表明糖酵解和TCA循環中的代謝增強以及PPP途徑中代謝減少對于脂質的積累具有重要作用。

2.3 分子水平改造

通常，核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCO)是參與碳固定的第一個關鍵步驟的酶，但RuBisCO在非光合作用的隱甲藻中的特定作用尚未明確闡明。然而就細胞代謝而言，在異養條件下，涉及CO2固定和光呼吸的途徑可能不是必需的。刪除這些高豐度但非必需基因如RuBisCO，可以優化碳通量并重定向能量流動(ATP和NADPH)。Diao等[37]選擇在自養條件下可能參與CO2固定的RuBisCO作為構建突變株的靶標。與野生型相比，RuBisCO基因的缺失促進了細胞的生長且在異養條件下增加了隱甲藻中脂質的含量?；谝合嗌V-質譜(LC-MS)的代謝組學分析也表明，RuBisCO基因的缺失有助于更多的碳或能量向細胞生長和脂質積累流動。

2.4 發酵法生產DHA的研究現狀

1962年，Javornick首次在海邊采集得到寇氏隱甲藻。美國哥倫比亞的Mertek公司已用該菌種實現了規?；a。2003年，Swaaf等[38]用葡萄糖為底物在生物反應器中通過分批補料的發酵方式培養寇氏隱甲藻ATCC 30772，在培養400 h之后，Swaaf等獲得的最大菌體生物量達到109 g/L，總脂質含量為61 g/L，DHA的含量為19 g/L。

目前，國內針對發酵法進行DHA生產的研究主要是集中于藻株誘變和發酵條件的優化等方面。2001年，王菊芳等[39]研究了3種無機鹽(NaCl、MgSO4和KH2PO4)對隱甲藻生長及DHA產量的影響，結果表明隱甲藻可在NaCl為唯一無機鹽的培養基中生長，DHA產量達到499.93 mg/L。2010年，梅志剛等[40]利用響應面法優化隱甲藻生產DHA的培養基配方，在優化后的培養基條件下，DHA產量達0.91 g/L，是優化前產量的2.48倍。2012年，孫中貫等[41]利用亞硝基胍對隱甲藻ATCC 30556進行誘變處理，最后得到的突變株的DHA產量達到1.057 g/L。 任路靜等[42]利用流加策略實現了隱甲藻生產DHA的高密度發酵，結果表明，在葡萄糖濃度為4 g/L左右時，流加碳氮比為30∶1的營養液對隱甲藻的生長和脂肪酸積累最有利，DHA產量達到4.08 g/L。2015年，王澍等[43]又對寇氏隱甲藻突變株產DHA的發酵培養基進行響應面優化。優化后在50 L發酵罐上進行放大實驗得到的DHA的產量為5.65 g/L，比優化前提高了10.35%。2016年，王澍等[44]又通過探究不同補糖時間和不同補糖量對寇氏隱甲藻突變株產DHA的影響，最后使DHA的產量可達到11.94 g/L。

3 總結

近年來，雖然對寇氏隱甲藻的改造和發酵的生產研究投入了大量的精力，但DHA生產過程中的產量低、成本高等瓶頸問題仍然存在，解決這些問題依舊迫在眉睫。除了傳統的學科知識和研究手段，合成生物學、系統生物學和CRISPR(規律間隔成簇短回文重復序列)等學科技術的興起，使人為控制微生物代謝從而提高目標代謝物產量成為現實。因此，構建高產DHA的工程藻株可以在這些學科的支持下進一步開展。本文為寇氏隱甲藻的下一步的研究方向作了三點展望：

(1)轉錄組學分析。通過轉錄組學分析研究隱甲藻發酵期間不同生長階段的代謝狀態。功能注釋后，鑒定與隱甲藻中脂肪酸和DHA生物合成潛在相關的基因和途徑。并基于氣相色譜-質譜(GC-MS)的代謝組學分析定義細胞中的小分子多樣性，這種手段有助于更好地了解隱甲藻的整體代謝，可以對隱甲藻中DHA生物合成的關鍵基因有深入了解。

(2)關鍵酶的研究。全面了解DHA生物合成途徑中的關鍵酶對高產DHA的寇氏隱甲藻工程藻株的構建具有非常重要的意義，并通過對其進行分子生物學研究達到人工構建的目的。同時我們還需要進一步研究寇氏隱甲藻生產DHA 途徑中的各種酶活性的變化，從而找到代謝關鍵節點，為調整代謝流等工作奠定基礎。

(3)基因組重測序。首先需要完善寇氏隱甲藻的全基因組信息，由于寇氏隱甲藻是真菌藻類，基因組信息龐大，因此需要長期仔細的分析全基因組信息來構建DHA完整的代謝網絡，然后再利用代謝組學等手段對DHA合成的整個代謝途徑進行分析，在確定了DHA在生物合成過程中的代謝限速步驟和關鍵控制基因之后，對與DHA生物合成相關的關鍵基因進行改造、重排或者修改，從而獲得可以高產DHA的人工寇氏隱甲藻工程藻株。