乳腺癌CTC與病理特征及預后相關性分析

阮國棟 王華 李志安

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，具有侵襲性、難治愈且易復發或轉移的特點，嚴重影響婦女身心健康甚至危及生命。我國乳腺癌發病率的增長速度非?？?、復發轉移率高，乳腺癌的診斷和治療依舊是一個研究熱點［1］。影像學結合病理學檢查是目前臨床檢測乳腺癌的主要手段，檢測方法均具有創傷性和重復性低的特點，且在腫瘤達到特定大小或已發生轉移時才能檢測到，易錯過最佳治療期。循環腫瘤細胞（Circulating Tumor Cell，CTC）檢測技術是一種實時無創的腫瘤診斷方法，操作簡單，具有可重復性，已被用于包括乳腺癌在內的多個癌種的臨床診斷［2-3］。在影像學發現微小轉移灶之前，CTC 檢測將成為檢測乳腺癌轉移及預后過程的有力工具。本資料將循環腫瘤細胞與乳腺癌的分期、分子分型進行綜合研究，研究乳腺癌 CTC 的表達水平與患者臨床病理特征以及預后的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集于2016年1～5月期間在本院就診的68例乳腺癌患者的臨床資料，年齡48～80歲，平均（64.3±16.4）歲。腫瘤直徑≥5cm者7例，＜5cm者61例；人表皮生長因子受體2（HER-2）陽性12例，HER-2陰性56例；TNM分期為Ⅰ～Ⅲ期，Ⅰ期21例，Ⅱ期33例，Ⅲ期14例；乳腺癌分子分型，Luminal A型9例，Luminal B型40例，HER-2過表達型10例，三陰型 9例。納入標準：（1）經穿刺活檢技術確診為乳腺癌；（2）均為初診患者，且腫瘤為單側、單發；（3）TNM分期為Ⅰ～Ⅲ期，臨床干預手段為手術治療結合化療；（4）無其他部位惡性腫瘤；（5）無炎癥性乳腺癌、哺乳期乳腺癌或已行包塊切除活組織檢查。隨訪：從第1次診療后開始，以電話形式每隔 3 個月隨訪1次，共隨訪4年。達到隨訪時間、患者意外死亡或失聯后終止隨訪。

1.2 CTC檢測方法在手術后化療前24h、輔助化療結束后24h使用BD采血管采集患者的外周血液樣本2份，每份7.5ml，室溫保存并于24h內處理。室溫條件下800g離心8min，棄掉上層血漿，保留至細胞層上5mm處。去除紅細胞向離心管中加入3ml專用的密度梯度離心分離介質，緩沖液去除血漿的血樣稀釋后，緩慢平鋪于離心介質上方。1050g離心8min。離心后緩慢取出采血管，將含白膜層的上層分離液全部轉移至一個新的離心管。于上述去除紅細胞的細胞懸液中加入適量的抗CD45的免疫磁顆粒，室溫條件下孵育30～60min。將免疫磁珠孵育后的樣本置于磁場下孵育5min，再將全部未結合磁珠的細胞懸液轉移至一個新的離心管，則該離心管中的細胞為去除了絕大多數紅細胞和白細胞的非血源性細胞。然后將富集后的細胞懸液，體積調整至100μl，加入同等體積的細胞固定液。緩慢吹打混勻后均勻涂于專用細胞防脫載玻片，于32℃過夜烘干。細胞涂片經潤洗后，用CEP8探針進行原位熒光雜交，加入200μl 緩沖液配制的抗體（CD45-Alexa fluor 594，CK18）室溫避光孵育2h，并用DAPI 熒光保存液封片，于正置熒光顯微鏡中立即觀察細胞。根據CTC判讀標準判定CTC細胞（CTC：DAPI+/CD45-/CEP8+，DAPI+/CD45-/CK+；WBC：DAPI+//CD45+/CEP8-/CK-）。

1.3 統計學方法 采用 SPSS 18.0統計軟件。計數資料以n或%表示，組間比較采用χ2檢驗。生存分析比較采用Mantel-Cox檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CTC細胞鑒定 利用基于淋巴細胞表面抗原的CD45免疫磁珠進行外周血CTC的陰性富集，結合免疫熒光染色和原位熒光雜交（FISH）技術進行乳腺癌CTC的鑒定。將DAPI+/CD45-/CEP8+和DAPI+/CD45-/CK+判定為CTC細胞。見圖1。

2.2 CTC與乳腺癌臨床病理特征的關系 CTC與乳腺癌病理特征關系如表1所示，腫瘤直徑＞5cm的患者與直徑＜5cm患者相比中更易檢測出CTCs陽性（P＜0.05）。乳腺癌患者CTC陽性率與腫瘤TNM分期顯著相關（P＜0.05），TNM分期為Ⅰ期CTCs陽性率為16.7%，Ⅲ期為45.8%，差異有統計學意義（P＜0.05）。不同年齡、不同乳腺癌分子分型及HER-2表達與CTCs陽性無顯著相關性（P＞0.05）。

表1 CTC與乳腺癌病理特征的關系［n（%）］

2.3 預后生存分析 根據患者化療前CTC陽性情況，將乳腺癌患者分為CTC陽性組44例，CTC陰性組24例。其中CTC陽性組48個月生存率為37.12%，CTC陰性組48個月生存率為60.12%，CTC陽性組48個月生存率低于CTC陰性組48個月生存率，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖 2。

圖2 CTC 陽性和CTC 陰性患者生存曲線圖

2.4 乳腺癌患者化療前后CTC檢測情況 化療前68例乳腺癌患者中CTC陽性率為35.3%（24/68），化療后CTC陽性率顯著下降為19.1%（13/68），差異具有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

乳腺癌發病率現居女性惡性腫瘤首位，且發病率呈逐年上升趨勢［4］。已有研究證實，CTC 對判斷早期乳腺癌及轉移性乳腺癌患者的預后均具有重要價值。常見CTC的富集包括流式細胞分選法、密度梯度離心法、膜過濾法和免疫磁珠富集法。由于膜過濾法和免疫磁珠分離方法的準確性較高并且無需較大樣本量，因而在CTC檢測中的應用更為廣泛?；诹馨图毎麡酥疚顲D45的免疫磁珠陰性富集的方法，靈敏性較高，對后續CTC鑒定所使用表面標志物的選擇更為靈活。CTC陰性富集之后，利用CD45、CK染色和FISH檢測實現CTCs的鑒定和分型。本資料中采用免疫磁珠分析方法分離CTC，將DAPI+/CD45-/CEP8+和DAPI+/CD45-/CK+判定為CTC細胞，在手術放化療前，檢測到24例患者CTC表達呈陽性，44例CTC表達呈陰性。

本資料結果中CTC陽性患者4年生存率為37.12%，CTC陰性患者為60.12%，差異具有統計學意義（P＜0.05）。此結果與梁志洪等應用膜過濾法檢測CTC在乳腺癌預后與化療評估中的結果相一致［4］。因此，本文實驗結果進一步證實了CTC陽性患者生存期短，可用于預估乳腺癌患者預期生存率。進一步分析了CTC檢出情況與病理的關系發現，乳腺癌患者CTC陽性率與腫瘤直徑大小及腫瘤TNM分期顯著相關（P＜0.05）。腫瘤直徑＞5cm的患者與直徑＜5cm患者相比中更易檢測出CTCs陽性（P＜0.05）。TNM分期為Ⅰ期CTCs陽性率為16.7%，Ⅲ期為45.8%，差異有統計學意義（P＜0.05）。而與患者年齡、乳腺癌分子分型及HER-2表達無顯著相關性（P＞0.05）。因此認為HER-2陽性的乳腺癌患者不一定會檢出CTC陽性，這與Ligthart等［5］報道相一致，該報道中HER-2陽性患者中29%呈現CTC陰性。本資料中68例乳腺癌患者化療前CTC陽性率為35.3%，化療后CTC陽性率顯著下降為19.1%（P＜0.05）。此結果與江秋晨等［6］結果一致，進一步證實CTC檢測可用于化療期間療效監測，還可用于評估化療療效及生存時間預測。

因此，對于治療前CTC陽性而治療后仍陽性的患者，可考慮適當強化化療方案，也可作為對于HR陽性患者延長內分泌治療的一個考量指標。同時本文樣本量小，需要前瞻性、大樣本、多中心的研究進一步驗證。