響應面優化花生芽中白藜蘆醇提取工藝

武鵬程，蒲云峰，張斌，張金榮，王麗玲，王強

塔里木大學生命科學學院，南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室（阿拉爾 843300）

花生（Arachis hypogaeaL.）是薔薇目、豆科、落花生屬的一年生草本植物，在亞洲、非洲和美洲等國家均有種植，我國新疆花生的種植已有100多年的歷史，因地處內陸腹地，具有典型的溫帶大陸性氣候，氣候干燥，降雨量少，種植花生具有不易滋生黃曲霉毒素的綠色優勢[1]?；ㄉ鸂I養豐富，其蛋白質含量約為25.8%，脂質含量為49.2%，碳水化合物含量為16.1%，水分含量為6.5%，灰分含量為2.3%。此外，花生還富含維生素C[2]、白藜蘆醇（Resveratrol，Res）等[3]。研究發現，花生萌芽后蛋白質逐漸降解為肽和氨基酸，其生物利用率顯著提高，脂肪含量顯著降低，維生素含量全面提高，營養因子得到改善，特別是具有重要生理功能的多酚類物質Res含量迅速增加[4]。

白藜蘆醇（Res）是一類天然非黃酮類多酚，廣泛存在于虎杖、花生、葡萄、桑葚等植物中[5]，是植物在受到誘導脅迫時自發啟動防御機制而大量產生的一種植物抗毒素[6]。Res無色、無味，難溶于水，易溶于乙醇、乙酸乙酯等有機溶劑，學名為3, 4, 5-三羥基二苯乙烯，分子式為C14H12O3，自然界中Res主要以順式Res苷和反式Res苷兩種形式存在[7]，具有抗癌、抗過敏、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、調節油脂代謝、保護心血管等多種生理活性功能[8-9]。以Res為主要成分的保健品，在美國、日本、加拿大等國家早已廣泛被消費者接受；在我國，近年來隨著研究者不斷的深入研究和推廣，Res相關產品也在逐漸被人們接受，呈現潛在良好的經濟效益及社會效益[10]。

此次試驗以新疆阿拉爾花生為原料，經發芽后使用超聲波輔助纖維素酶法提取Res，以期為Res的提取提供理論依據。

1 試驗部分

1.1 材料與儀器

花生芽：取顆粒飽滿，大小相等完整的花生，整齊、等距擺放在已滅菌的塑料育苗托盤上，將培育盤壓水盤依次裝入豆芽機中，避光，透氣，在25～30 ℃條件下培養50 h，期間每隔1 h澆1次水，每隔4 h換1次水，將發芽后的花生（長約15 cm）洗凈，瀝干，于50 ℃烘24 h，粉碎，備用。

Res標準樣品（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；無水乙醇、甲醇（分析純，天津市北聯精細化學品開發有限公司）；纖維素酶（山東西亞化學股份有限公司）。

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津）；JP-060S型數控超聲波清洗器（深圳市潔盟清洗設備有限公司）；SHA-B型水浴恒溫振蕩器（江蘇金怡儀器科技有限公司）；RE-3000A型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；DYJ-2016豆芽機（中山市德容電子科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 Res的測定

色譜柱，ZORBAXSB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A為甲醇；流動相B為0.5%甲酸；流速0.7 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長305 nm。

1.2.2 Res標準曲線的建立

精確稱取5 mg Res標準品，用50 mL甲醇溶解并定容成100 μg/mL的儲備液。將儲備液進行一定梯度的稀釋，配制成0.2，1，2，5，10，20，40和80 μg/mL的對照液。

將制備的對照液經微孔濾膜過濾后上高效液相色譜，測定其峰面積，得線性方程：Y=122 979X-128 545（R2=0.998 4）。式中，X為質量濃度；Y為不同濃度下的相應峰面積。結果顯示，此曲線在一定范圍內的線性關系良好，適合用于Res的測定。

1.2.3 Res的提取

以料液比、超聲溫度、時間和酶添加量4個因素進行單因素試驗，精確稱取1.000 g備用花生芽粉，加入一定量的70%乙醇和纖維素酶，振蕩混勻，在超聲提取儀中調節不同溫度提取一定時間，取濾液離心，過0.22 μm微孔濾膜，然后上高效液相色譜儀測定其含量，每次試驗重復3次，結果取平均值。由線性回歸線性方程得出Res濃度。式（1）計算Res提取率。

Res提取率（mg/g）=C×V/M×稀釋倍數 （1）

式中：M為花生芽粉的質量，g；V為提取液稀釋后的體積，mL；C為測定的樣液中Res質量濃度，μg/mL。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對花生芽中Res提取率的影響

準確稱取適量花生芽粉，纖維素酶添加量為8 mg/g，提取溶劑為70%乙醇，料液比為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50（g/mL），在50 ℃的條件下酶解1.5 h，經40 kHz超聲波處理30 min，分析料液比對Res提取率的影響，結果如圖1所示。

隨著料液比的增加，Res提取率增加，當料液比為1∶40（g/mL）時，提取率達到最大；料液比超過1∶40（g/mL）后，Res提取率略有下降，這是由于當溶質的量一定時，增加溶劑的量有利于原料中有效成分向浸提液中擴散，提高Res的浸出率，但繼續增加浸提溶劑，原料中的有效成分會被稀釋。綜合考慮提取率和經濟效益的影響，選擇料液比1∶40（g/mL）為宜。

圖1 料液比對花生芽中Res提取率的影響

2.1.2 超聲波溫度對花生芽中Res提取率的影響

準確稱取5份1.000 g花生芽粉，纖維素酶添加量為8 mg/g，提取溶劑為70%乙醇，在料液比1∶40（g/mL）的條件下酶解1.5 h，分別經30，40，50，60和70 ℃的40 kHz超聲波處理30 min，分析超聲波溫度對Res提取率的影響，結果如圖2所示。

隨著超聲波處理溫度的提高，Res提取率增加，當超聲波處理溫度為50 ℃時，提取率達到最大；超聲波處理溫度超過50 ℃后，Res提取率下降，這是由于根據布朗運動原理，溫度升高，組織內的分子運動加劇，擴散和滲透速度加快，溶出的Res增加，但繼續提高超聲波處理溫度，會導致熱敏性Res喪失生理活性。因此，提取溫度選擇50 ℃最佳。

圖2 超聲波溫度對花生芽中Res提取率的影響

2.1.3 超聲波時間對花生芽中Res提取率的影響

準確稱取5份1.000 g花生芽粉，纖維素酶添加量為8 mg/g，提取溶劑為70%乙醇，在料液比1∶40（g/mL）的條件下酶解1.5 h，置于50 ℃ 40 kHz的超聲波提取10，20，30，40和50 min，分析超聲波處理時間對Res提取率的影響，結果如圖3所示。

隨著超聲波處理時間的延長，Res提取率增加，當超聲波處理時間為30 min時，提取率達到最大；超聲波處理時間超過30 min后，Res提取率下降，其原因可能是隨著處理時間的延長，花生芽細胞破碎程度增強，溶出的Res增加，但繼續增加超聲波處理時間，Res的穩定性會被破壞，導致含量降低，因此確定超聲波處理時間30 min。

圖3 超聲時間對花生芽中Res提取率的影響

2.1.4 酶添加量對花生芽中Res提取率的影響

準確稱取5份1.000 g花生芽粉，提取溶劑為70%乙醇，料液比為1∶40（g/mL），分別添加6，8，10，12和14 mg酶，在50 ℃條件下酶解1.5 h，經40 kHz超聲波處理30 min，分析酶添加量對Res提取率的影響，結果如圖4所示。

當酶添加量為8 mg時，Res提取率最大；繼續增加酶的添加量，Res提取率反而下降，其原因可能是大量纖維素酶過分分解花生芽，導致Res提取率下降。因此，酶添加量選擇8 mg左右為宜。

圖4 酶添加量對花生中Res提取率的影響

2.2 響應面試驗結果

在單因素試驗結果的基礎上，根據Box-Behnken設計原理，以花生芽中Res提取率為響應值，選取超聲波溫度（A）、超聲時間（B）、料液比（C）、酶添加量（D）為自變量，以Res的提取率為響應值，設計響應面試驗，因素水平見表1，試驗結果見表2，回歸模型方差分析見表3。

利用Design-Expert V 8.0.6.0軟件統計分析，由花生芽中Res的濃度（Y）對超聲溫度（A）、超聲時間（B）、料液比（C）、酶添加量（D）建立回歸模型，對表2中的試驗數據進行多元二次多項式回歸擬合，得到的四元二次回歸方程：

Y=+5.43+0.023A-0.097B+0.033C-0.046D-0.093AB+ 0.003 815AC+0.050AD-0.092BC+0.20BD-0.49CD-4.16A2+0.75B2+0.49C2+0.43D2

由表3可知，模型線性以及平方均顯著，失擬項不顯著，表明該方程對試驗擬合情況好，試驗誤差小?；貧w方程較好地描述了各因素與響應值之間的真實關系，因此，可以用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結果進行分析。由表3可知，所選取的因素對Res提取率的影響為B＞D＞C＞A，即超聲時間對Res提取率的影響最大，其次為酶添加量，最后是料液比和超聲溫度。

表1 響應面試驗因素水平表

表2 響應面試驗結果

由該回歸方程作出中心組合設計試驗所得的6組響應面曲面圖，如圖5～圖10所示，以確定最佳提取工藝條件。由此可知，Res理論最大提取率為0.805 8 mg/g，其所對應的提取條件為超聲溫度49.98 ℃，超聲時間35.00 min，料液比1∶34.99（g/mL），酶添加量7 mg。

根據軟件得到的結果，但考慮實際的操作性，建議對影響因素較小的超聲溫度和料液比進行合理控制，將最佳反應條件調整為超聲溫度50 ℃，超聲時間35 min，料液比1∶35（g/mL），酶添加量7 mg。在此條件下，Res提取率為0.823 9 mg/g，驗證了方程的可靠性。

表3 回歸方程的方差分析

圖5 超聲時間和超聲溫度交互作用對花生芽中Res提取率的影響

圖6 料液比和超聲溫度交互作用對花生芽中Res提取率的影響

圖7 酶添加量和超聲溫度交互作用對花生芽中Res提取率的影響

圖8 料液比和超聲時間交互作用對花生芽中Res提取率的影響

圖9 酶添加量和超聲時間交互作用對花生芽中Res提取率的影響

圖10 酶添加量和料液比交互作用對花生芽中Res提取率的影響

2.3 驗證比較試驗

由表4可知，超聲波纖維素酶復合提取法的Res提取率最高。

表4 4種不同提取方法比較

3 結論

利用響應面法優化超聲波輔助纖維素酶提取花生芽中Res。結果表明，Res最佳提取工藝條件為超聲波處理溫度50 ℃，超聲波處理時間35 min，料液比1∶35（g/mL），酶添加量7 mg。在此條件下，Res的最大提取率可達0.823 9 mg/g，與理論預測值相接近。通過比較驗證，結果表明超聲波輔助纖維素酶提取工藝能更有效地提取花生芽中Res，并優于超聲波或纖維素酶單一提取工藝?；ㄉl芽后大大提高了Res的含量，是Res的良好來源?；ㄉl芽后提取Res，為花生仁的深加工提供了新的思路，并具有潛在的經濟價值和應用價值。