溶血對液相色譜串聯質譜檢測血清中維生素A、E、D、K的影響

黃和飛，李佳興，谷葉，李澤東，李俊宇，夏躍蓮，呂小波

（昆明和合醫學檢驗所，云南 昆明 650106）

維生素是維持人體正常生理功能所必須的一類小分子有機化合物，在體內不能合成或合成量極低，必須由食物供給。維生素既不構成機體的組成成分，也非功能物質，然而在孕育生命及生長發育、調節人體物質代謝、維持正常生理功能、防治疾病等方面卻發揮著極其重要的作用。為提高臨床醫師對患者維生素代謝狀況評估及加強對防治維生素缺乏的了解，進一步推動我國維生素研究的開展，自2006年以來，中華醫學會腸外腸內營養學分會及北京醫學會腸外腸內營養學分會專家討論制定《維生素制劑臨床應用專家共識》[1]。隨著臨床檢驗技術的不斷發展及檢驗設備的不斷更新，液相色譜串聯質譜因靈敏度高，特異性強，越來越多的被應用于小分子物質檢測。近年來，液相色譜串聯質譜法檢測維生素受到廣泛關注及應用，也為臨床診斷及病情評估提供有效依據，但是在對血液標本進行檢驗時，常見血液溶血現象，溶血是血液樣本采集中最常遇到的問題，溶血樣本由于響應低、有基質效應等問題會影響LC-MS/MS的測定結果[2]，《中華人民共和國藥典（2015版）》、歐洲藥品管理局、美國食品與藥品監督管理局均要求關注溶血樣本的基質效應。該現象會嚴重影響檢驗結果的準確性，進而影響臨床診斷結果，導致預后效果不理想，因此，在檢驗過程中應盡量避免血液標本溶血現象[3-4]。本研究探討溶血對維生素A、E、D、K測定結果的影響，旨在為臨床取樣提供參考，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血樣來源與選擇 30 名健康志愿者均為昆明和合醫學檢驗所員工，上午11：00 空腹采血，血樣置于普通紫帽采血管中。

1.1.2 儀器與試劑 LC-MS/MS AB Sciex-4500MD、UV2802紫外-可見分光光度計、XA105電子天平、H2050R-1高速離心機、旋渦振蕩器、氮吹儀、屈臣氏蒸餾水、HPLC 級甲醇、甲酸（質譜級）、維生素A（視黃醇）：Sigma（USA）、維生素E（α-生育酚）：Sigma（German）、維生素A 同位素內標：buchem bv、維生素 E 同位素內標：TRC、維生素 D2：Sigma（USA）、維生素 D3：Sigma（USA）、維生素 D2～d3：ISO（USA）、維生素 D3～d6：TRC（CAN）、維生素K1：中檢所、維生素K1～d7：Sigma-aldrich、維生素K2（MK4）：Sigma-aldrich；維生素K2（MK4）：Sigma-aldrich、維生素K2（MK4）-d7：TRC。

1.1.3 血樣采集 30 名健康志愿者，每人用2 支5 mL 的紫帽采血管自肘靜脈分別采2管血液，每管3 mL；然后分別取1管血液，共30 管作為溶血對照組，另外30 管作為正常對照組。30管正常對照組血液樣本3 000 rpm離心20 min，分離血漿備用。另外30管溶血對照組血液樣本按上述方法用一次性注射器針頭渦旋攪拌3 min，或劇烈震蕩1 min，使血樣發生溶血；溶血樣本3 000 r/min 離心20 min，分離血漿備用，分成2份，1份用于檢測溶血率，1份用于檢測維生素A、E、D、K的濃度。

1.1.4 溶血模型的建立 按文獻[5-6]方法，將取樣后的血樣用一次性注射器針頭渦旋攪拌3 min，或劇烈震蕩1 min，使血樣發生溶血。

1.1.5 樣本制備 ①陽性對照管：取1 支正常血液樣本（2 mL），加入等體積的純化水2 mL裂解紅細胞，制備陽性對照管；②陰性對照管：用0.9%氯化鈉溶液或純化水作為陰性對照；③檢測：用紫外-可見分光光度計于545 nm檢測陽性對照管（3管）、陰性對照（3管）及溶血待測樣本的吸光度，并計算溶血率。溶血率（%）=（溶血樣本-陰性對照）/（陽性對照-陰性對照）[5-6]。

1.2 方法

1.2.1 生物樣本前處理 全血樣本3 000 r/min離心10 min，收集血清200 μL，加入無水乙醇400 μL，振蕩5 min，1.2 mL正己烷振蕩提取6 min，離心10 min取上清進行氮氣吹干，流動相溶解后，取100 μL上機檢測。

1.2.2 色譜和質譜條件 流速0.4 mL/min，色譜柱：Agilent，C8，5 μm，2.1 mm×50 mm；柱溫箱25 ℃，進樣體積10 μL，分析時間6.5 min，流動相：有機相純甲醇，水相（0.1% 甲酸），進行梯度洗脫，梯度程序，見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序（%）Table 1 Gradient elution procedures for liquid chromatography(%)

電噴霧電離（ESI 源），正離子掃描，采集模式：MRM 掃描，儀器參數分別為：CUR，15；CAD，5；TEM，350；Gas 1，20，DP，70 V；EP，10 V；CE，20 V；離子通道MRM 分別為：VA，m/z 269→213；VA-IS，m/z 272→216；VE，m/z 431→165；VE-IS，m/z 437→171；VD2，m/z 413→337；VD2-IS，m/z 416→340；VD3，m/z 401→365；VD3-IS，m/z 407→371；VK1，m/z 451→187；VK1-IS，m/z 458→194；VK2，m/z 445→187；VK2-IS，m/z 452→194。

1.3 統計學方法 采用SPSS 11.5統計軟件進行數據分析，計量資料以“±s”表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 標準曲線建立 分別精密稱量AEDK 標準品，并根據SOP制備相對應的標準工作溶液，每個項目重復3次，標準曲線方程及相關系數，見表2～4。

表2 VA、VE測定標準曲線方程及相關系數Table 2 VA,VE determination of standard curve equation and correlation coefficient

表3 VD2、VD3測定標準曲線方程及相關系數Table 3 VD2,VD3 determination of standard curve equation and correlation coefficient

表4 VK1、VK2測定標準曲線方程及相關系數Table 4 VK1,VK2 determination of standard curve equation and correlation coefficient

2.2 溶血對維生素A、E、D、K的影響 溶血對照組的樣本溶血率平均為34%；同一組樣本溶血后，維生素A的含量明顯降低，與溶血前對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01）；而維生素E、D2、D3、K1、K2的含量無明顯變化，與溶血前對照組比較差異無統計學意義，見表5。

2.3 不同溶血程度對維生素A、E、D、K的影響趨勢 不同程度溶血后，VA、VD2、VD3、VK1、VK2的含量與正常值比較差異無統計學意義，且同一組溶血樣本，輕、中、重度溶血后，各組檢測值比較差異無統計學意義；輕、中度溶血后，VE的含量與正常值比較差異無統計學意義，但重度溶血組檢測值與中度溶血組及正常值之間比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表6～7。

2.4 溶血程度與維生素A、E、D、K 的相關性考察（皮爾遜相關系數R） 在不同程度溶血期間，當溶血率＞50%時，VA、VE的皮爾遜相關系數R值均≥0.9，說明VA、VE含量與重度溶血相關性明顯；在不同程度溶血期間里，VD、VK 的皮爾遜相關系數R值遠＜0.9，說明VD、VK 含量與溶血程度無相關性，見表8～9。

2.5 不同溶血程度平均值與維生素A、E、D、K的平均值相關性考察（皮爾遜相關系數R） 在不同程度溶血期間，VA的皮爾遜相關系數R值＞0.9，說明VA含量與溶血相關性明顯；VE的皮爾遜相關系數R值接近0.9，說明VE含量與溶血也有較大相關性；VD、VK的皮爾遜相關系數R值遠＜0.9，說明VD、VK含量與溶血程度沒有相關性，見表10～11。

表5 樣本溶血對維生素A、E、D、K的血藥濃度影響（±s）Table 5 Effects of hemolysis on the plasma concentrations of vitamin A,E,D and K(±s)

表5 樣本溶血對維生素A、E、D、K的血藥濃度影響（±s）Table 5 Effects of hemolysis on the plasma concentrations of vitamin A,E,D and K(±s)

檢驗項目VA（μg/mL）VE（μg/mL）VD2（ng/mL）VD3（ng/mL）VK1（ng/mL）VK2（ng/mL）溶血前對照組（n=30）檢測結果0.46±0.13 11.40±2.97 0.87±0.42 17.23±6.51 1.29±0.89 0.14±0.10溶血后對照組（n=30）檢測結果0.37±0.12 10.70±2.89 0.88±0.41 17.10±6.01 1.46±0.64 0.12±0.07溶血率（%）0.34±0.22

表6 不同溶血程度對維生素A、D的血藥濃度影響趨勢（±s，n=30）Table 6 Influence trend of different hemolysis degree on blood drug concentration of vitamin A and D(±s,n=30)

表6 不同溶血程度對維生素A、D的血藥濃度影響趨勢（±s，n=30）Table 6 Influence trend of different hemolysis degree on blood drug concentration of vitamin A and D(±s,n=30)

溶血程度（%）溶血率10～30溶血率31～60溶血率61～100 VA（mg/L）溶血值0.38±0.14 0.33±0.06 0.32±0.03正常值0.45±0.15 0.42±0.11 0.44±0.03 VD2（ng/mL）溶血值0.99±0.46 0.78±0.33 0.75±0.39正常值0.97±0.49 0.85±0.36 0.68±0.17 VD3（ng/mL）溶血值17.24±6.88 16.95±6.72 15.88±2.95正常值17.33±7.34 16.43±8.05 17.03±3.12

表7 不同溶血程度對維生素E、K的血藥濃度影響趨勢（±s，n=30）Table 7 Influence trend of different hemolysis degree on blood drug concentration of vitamin E and K(±s,n=30)

表7 不同溶血程度對維生素E、K的血藥濃度影響趨勢（±s，n=30）Table 7 Influence trend of different hemolysis degree on blood drug concentration of vitamin E and K(±s,n=30)

注：與溶血率31～60組比較，aP＜0.05；與正常值比較，bP＜0.05

溶血程度（%）溶血率10～30溶血率31～60溶血率61～100 VE（mg/L）溶血值11.07±3.11 10.40±1.37 7.68±1.28ab正常值11.47±3.14 11.18±1.73 11.17±2.26 VK1（ng/mL）溶血值1.27±0.49 1.68±0.64 1.18±0.30正常值1.11±0.55 1.24±0.77 0.92±0.32 VK2（ng/mL）溶血值0.10±0.04 0.12±0.05 0.16±0.16正常值0.11±0.07 0.11±0.07 0.16±0.08

表8 不同溶血程度與維生素A、D2、D3相關性分析（n=8）Table 8 Correlation between different hemolysis degrees and vitamin A,D2 and D3(n=8)

表9 不同溶血程度與維生素E、K1、K2相關性分析（±s，n=8）Table 9 Correlation between different hemolysis degrees and vitamin E,K1 and K2(±s,n=8)

表9 不同溶血程度與維生素E、K1、K2相關性分析（±s，n=8）Table 9 Correlation between different hemolysis degrees and vitamin E,K1 and K2(±s,n=8)

溶血程度（%）溶血率10.0～20溶血率20.1～30溶血率30.1～60溶血率60.1～100 VE（mg/L）溶血值10.42±3.01 11.46±3.27 11.65±1.37 7.68±1.28 R值0.37 0.21 0.87 0.94 VK1（ng/mL）溶血值1.03±0.37 1.41±0.51 1.39±0.64 1.18±0.30 R值0.43 0.64 0.23 0.63 VK2（ng/mL）溶血值0.11±0.02 0.10±0.05 0.14±0.04 0.16±0.03 R值0.39 0.04 0.10 0.75

表10 不同溶血程度平均值與維生素A、D2、D3平均值相關性分析（n=32）Table 10 Correlation between the mean value of different hemolysis degrees and the mean value of vitamin A,D2 and D3(n=32)

表11 不同溶血程度平均值與維生素E、K1、K2血藥濃度平均值相關性分析（n=32）Table 11 Correlation between the mean value of different hemolysis degrees and the mean value of vitamin E,K1 and K2(n=32)

3 討論

臨床檢驗能為診斷和治療提供科學的數據支持，檢驗結果的準確性對于臨床診斷的準確性及治療的有效性具有直接影響[7]，只有做好檢驗分析前的質量控制，才能有效確保后續工作質量。但是，本研究結果發現，溶血樣本對維生素檢測結果的影響機制大致可歸納為以下幾個方面：①對化合物穩定性的影響：溶血的發生會導致紅細胞中的部分物質（如酶）釋放到血清/血漿中［8］。這些物質可能會造成目標化合物在血清/血漿基質中穩定性的改變［9-10］，具體表現為紅細胞破裂后釋放的血紅蛋白引起測量誤差，血紅蛋白中含有過氧化物酶和超氧化物歧化酶，由于維生素A屬于脂溶性維生素，可作為阻斷反應鏈的抗氧化劑，與有機過氧自由基結合，其中過氧化物酶和超氧化物歧化酶水平與血清中視黃醇（維生素A）水平有密切關系，可相互作用，直接影響機體的抗氧化系統，調控機體抗氧化能力［11］；②紅細胞對待測物有一定的吸附作用，尤其在重度溶血的樣本中，紅細胞濃度過高，雖然前處理已進行蛋白質沉淀和液液萃取，但樣本中仍有大量紅細胞未被除去，進入質譜后，干擾待測物信號；③對色譜分離的影響［12］：溶血樣本在萃取后可能會有一些特有的與待測物質共流出的內源性干擾。使用基于非溶血基質開發的色譜分離方法，可能無法將這些干擾與待測化合物分離；④對基質效應的影響：溶血的發生會產生溶血基質特有的基質效應，可能引起離子抑制或增強，進而影響試驗的總體精密度和準確度［13］。本研究中存在的局限或不足是無法通過肉眼來判斷溶血程度的大小，目前尚無有統一的溶血判斷標準，為保證維生素檢測的準確性，在日常樣本采集中盡量避免溶血。

有研究結果顯示，通過優化檢測方法、增強抗干擾能力、提升檢測敏感性，可消除溶血對LC-MS/MS檢測結果的影響。分析原因為，①溶血樣本中有干擾峰，可優化色譜條件，如流動相、色譜柱、洗脫梯度等，使待測物與基質分離[14]；Hughes等[2]在檢測血漿中的阿托伐他汀時，通過優化流動相中有機相和水相的比例，消除溶血樣本中的干擾峰對內標物的影響。②溶血樣本中待測物信號受到抑制，一方面可優化樣本前處理過程，盡可能去除溶血產生的雜質，Hughes 等[2]通過在固相萃取處理前先進行蛋白沉淀，并在固相萃取處理時多進行一步酸洗，成功消除了溶血對卡維地洛定量分析的影響。另一方面也可優化離子源種類和質譜參數，提高敏感性；一般情況下，LC-MS/MS常用的離子源克服基質效應的能力依次為大氣壓光噴霧電離源、大氣壓化學電離源、電噴霧電離源[15]。③溶血樣本與非溶血樣本間的差異較大，可選用合適的內標。與結構類似物作為內標相比，同位素標記的內標可更加準確地修正基質效應對結果的影響，因此，應盡可能使用穩定同位素標記的內標以消除基質效應的影響[16]。

綜上所述，溶血對于維生素A 有較大影響，臨床采集血液樣本時應嚴格遵守操作規程，防止溶血現象發生，確保檢驗結果的準確性。