薄層色譜與表面增強拉曼散射光譜聯用技術的研究進展

沈正東，孔憲明，喻 倩，楊占旭

遼寧石油化工大學石油化工學院，遼寧 撫順 113001

引 言

近幾年，環境污染、食品安全等一系列問題已經引起了國內外的高度關注。根據有關報道[1]，土壤和飲用水的污染會直接或間接威脅到人類的健康，污染源以食物鏈富集的傳播方式使食品受到不同程度的污染。目前，對于環境污染物一些常規的檢測方法包括生態毒理檢測診斷[2]，高效液相色譜與紫外(HPLC-UV)或熒光檢測器(FLD)的聯用[3]，氣相色譜和質譜聯用(GC-MS)[4]等方法。然而，生態毒理檢測診斷法，對于種類復雜性和多樣性的污染物檢測效果不靈敏，HPLC-UV和HPLC-FLD不便于現場快速檢測，GC-MS價格昂貴且對難揮發的物質檢測效果不理想。因此，對研發具有快速、靈敏及準確度高的檢測設備顯得尤為重要。SERS是一種具有高選擇性和靈敏性的分子振動波譜，它具備分子級別的檢測水平。

SERS技術在疾病診斷[5]、藥物分析、食品安全及環境監測等領域具有廣闊的應用前景。此外，SERS技術還成功應用于芳香族污染物的定性定量檢測[7]。然而，在實際檢測過程中，被測組分含量極低且待測體系中混有不同的組分，直接利用SERS技術無法對實際的混合物樣品進行檢測。需要先經過萃取或色譜等技術對待測物進行分離，然后通過SERS光譜進行檢測。

1 表面增強拉曼散射光譜

SERS是近年來受到高度關注的一種分析技術[8]。1974年，英國科學家Fleischmann等[9]，發現吡啶在粗糙的銀電極表面其拉曼譜線強度會出現明顯的增強效果，當時他們把這種增強效果歸因于有效面積的增大，從而獲得了更強的分子信號。1977年，Van Duyne等[10]重復實驗發現，粗糙銀表面吡啶分子與普通拉曼光譜相比其強度可以提高105～106倍，這種不同尋常的增強效果引發了當時科學界的高度關注，這種與貴金屬表面粗糙程度有關的拉曼增強現象被稱為表面增強拉曼散射(SERS)。

1.1 SERS的增強機理

隨著納米科技的發展，SERS的應用范圍越來越廣闊，但是對于表面增強拉曼效應的機理仍然存有分歧，目前較為認可的理論是電磁增強和化學增強[11]。在某一具體的增強體系中很難區分兩者的貢獻，一般認為是兩者共同的作用，前者起著主導的作用。電磁增強機理著眼于自由電子金屬表面的粗糙程度，當到達一定的程度，入射光就會與金屬基底產生表面局域電場，從而發生共振增強。在對于增強機理研究的過程中，研究者提出了相關的一些理論模型對電磁增強機理進行了探討，其中較為成熟的理論模型有表面等離子共振(surface plasma resonance,SPR)模型、天線模型、鏡像場(image field model)模型，在上述這些理論模型中表面等離子共振模型得到大多數人的認可，被認為是SERS信號的主要來源。金屬表面的自由電子在入射光的作用下形成一種規律性疏密振動,在表面聚集形成表面等離子激元,到達一定程度時激發的范圍呈現在一定的區域則被稱為表面等離子體，當產生的電磁波信號與金屬表面共同作用時會產生震蕩，頻率相同時則引起共振，產生的等離子體被限定在一定的區域，此時，當光照在金屬粒子表面就會產生局域表面等離子體(LSPR)，使得金屬納米粒子的電場強度發生明顯變化，與此同時，局域電場也會得到相應增強。通過實驗和理論計算研究表明，電磁場的增強受金屬納米粒子的尺寸、形狀、組成、粒子聚集程度以及局域的環境的影響等[12]。根據[圖1(a)—(d)]，可以了解到，當吸附分子與表面間距增大時LSPR的電場強度呈現指數下降，電磁增強作用范圍大致為1～10 nm。

圖1 (a)球形納米粒子LSPR的激發示意圖;(b) 三角形納米顆粒(700 nm)，球形納米顆粒的二聚體(520 nm)和橢圓形納米顆粒(695 nm)的銀納米顆粒周圍電磁場增強的理論模擬[12]Fig.1 (a) Illustration of the excitation of the LSPR of spherical nanoparticles;Theoretical simulations of the electromagnetic field enhancement around silver nanoparticles of (b) a triangular nanoparticle (700 nm),a dimer of spherical nanoparticles (520 nm),and an ellipsoidal nanoparticle (695 nm)[12]

上述這些現象的產生僅僅依靠電磁增強機理無法闡述，必須借助于化學增強機理加以解釋?；瘜W增強是由于分子吸附在金屬基底表面的物質分子極化率變化引起的增強，其中備受關注的電荷轉移模型和化學活性位模型。因此，對于具體的某一個增強體系而言，電磁增強和化學增強都做出了相應的貢獻。

1.2 SERS的基底制備

SERS研究的重要環節之一是SERS基底的制備。只有完善了基底的制備，才能為后續實驗提供一個基本的保障和獲得更好的檢測效果。因此，新型基底的制備成為研究者探索的一個目標。SERS基底的制備方法有多種，常見的方法有貴金屬顆粒溶膠法、壓印光刻法、模板法和自組裝法等。其中，在眾多的SERS基底制備的方法中，貴金屬顆粒溶膠法最為常用，主要包括了抗壞血酸還原法、檸檬酸鹽還原法[圖2(a,b)]。貴金屬溶膠顆粒法采用加熱金屬鹽溶液，然后向其中加入合適的還原劑，通過對反應條件的調節以及表面活化劑的加入來控制金屬溶膠的顆粒大小和形貌，所制備的金屬溶膠粒徑分布在10～190 nm之間，具有良好的穩定性，可以滿足實驗需求。

圖2 (a)制備的金納米顆粒的紫外可見吸收光譜和(b)掃描電子顯微鏡(SEM)[13]Fig.2 The UV-Vis absorption spectrum (a) and scanning electron micrograph (SEM) (b) of as-prepared colloidal Au NPs[13]

2 薄層色譜

薄層色譜法是能夠對含有多種組分的混合物進行分離的一種色譜分析方法，具有操作簡單、分離速度快等優點。主要是針對于色譜后衍生化處理、脫附以及含有懸浮微粒的樣品。常見的薄層色譜分為兩大類，一種是常規薄層色譜，另一種是高效薄層色譜，由于前者存在分離效果不理想、展板時間久、對展開劑的需求量較大的缺點。朱全紅等[14]通過提升固定相的性能，以及吸附劑的吸水性和疏水性，大大提高了薄層色譜的分離能力和選擇性能(圖3)。常見的高效薄層色譜有棒狀薄層色譜、旋轉薄層色譜、包合薄層色譜、過壓薄層色譜、膠束薄層色譜。高效薄層色譜的應用在很大程度上提升了分離的性能、重現性和靈敏度，滿足了很大一部分研究的需求。

圖3 連續拉曼掃描的TLC-SERS研究的示意圖[15]Fig.3 Schematic representation of the TLC-SERS study of continuous raman scanning[15]

3 薄層色譜與表面增強拉曼光譜聯用技術的發展與應用

SERS技術作為一種靈敏的光譜技術，已經在生物、化學以及物理領域取得了各自的應用，但是對于一些混合體系而言，僅僅依靠SERS技術很難實現物質的準確測定，一定程度上限制了SERS技術的發展。TLC分離技術具備良好的分離功能，TLC與SERS技術的聯用，能夠解決混合體系檢測困難的問題。然而，TLC基板材料的選擇直接影響到SERS檢測過程中背景干擾等問題。因此，選擇合適的TLC基板材料能夠為后續實驗提供更好的檢測條件。以往研究中[16]，通過選用硅藻土制備的TLC基板，可以高效、靈敏的完成樣品的分離和檢測，同時，解決了基板背景干擾的問題。

TLC-SERS聯用技術是對色譜分離和光譜檢測中各自優點的聯用。1977年Henzel對TLC-SERS聯用進行了相關的研究[17]。經過幾十年的迅速發展，該技術在微量樣品分離和檢測方面取得了顯著的效果，并且，已經成功應用于多環芳烴、中草藥以及食品添加劑等混合物的分離檢測。表1對TLC-SERS聯用的研究對象及應用體系進行了相應的研究調查，證實了該方法能夠快速、靈敏、高效的檢測出非法添加劑、染料、有機污染物等成分。

表1 TLC-SERS聯用技術的應用Table 1 Application of thin layer chromatography-surface enhanced Raman combined technology

3.1 TLC-SERS在環境污染物檢測中的應用

目前，土壤中污染物主要是有機污染物和重金屬污染物，其次是無機、生物和放射性污染物[32]。無機、放射性物質和生物類物質污染物來源相對單一，易于識別的特點，往往很容易被檢測到，但有機和重金屬污染物來源復雜且豐富，具有毒性強、難降解、分布范圍廣等特點，一旦長時間富集就會嚴重威脅到生態環境和人體健康。Li等[33]利用TLC-SERS聯用技術現場檢測水中苯類污染物。通過對分離過程TLC板的制備材料和檢測過程中聚集劑、銀溶膠、積分時間及功率的篩選，對含有苯類污染物的廢水進行TLC-SERS檢測。檢測到廢水中對甲苯胺、對硝基苯胺和間苯二胺的含量與傳統的檢測儀器(如GC-MS)檢測結果相似，TLC-SERS前處理更為方便、耗時短，此外，TLC-SERS具備現場快速檢測的優勢，從而減少了運輸和儲存引起的誤差。為現場監測環境污染物提供了一個快速、便捷的檢測方法(圖4)。Takei小組[23]制備了一種內置SERS層的薄層色譜板，SERS層是通過吸附準單分散二氧化硅納米粒子，然后真空形成的貴金屬的沉積，用于TLC分離的化學物質的原位測定。通過對含有1,2-二(4-吡啶基)乙烯(BPE)、結晶紫(CV)和羅丹明6G(R6G)組成的混合物進行分離，在不同的位置獲得對應的SERS譜。內置的SERS層納米粒子可以容易地從底部照射，而不會被凝膠層阻擋，比顯影后將膠體滴加到薄層色譜板的方法更靈敏和更均勻。TLC-SERS技術在環境污染物檢測方面不斷地進行改進，從最初的增強機制到后續的實驗材料以及實驗條件的篩選，逐步完善了該聯用技術在檢測性能和檢測時間上存在的不足。并且，實現了儀器的小型化和簡單化，同時還提高了檢測的準確度。

圖4 用于現場檢測廢水中取代芳香族污染物的TLC-SERS示意圖兩個插入圖像分別顯示了空白TLC板和沉積的銀納米顆粒TLC板的SEM特征[33]Fig.4 Schematic illustration of TLC-SERS for on-site detection of substituted aromatic pollutants in wastewaterTwo insert images show the SEM characterization of the blank TLC plate and the silver nanoparticles deposited TLC plate,respectively[33]

3.2 TLC-SERS在食品安全檢測中的應用

食品中染色劑和調味劑的添加以及食品變質產生的激素的問題，近幾年引起了人們的高度關注。Gao等[34]利用分子印跡聚合物薄層色譜與表面增強拉曼光譜的生物傳感器(MIPs-TLC-SERS)，對添加在辣椒粉末中的蘇丹紅進行檢測，最低檢測限到達1 mg·kg-1(m/m)，該方法成功地應用于食品在線檢測。Hu等[35]提出了一種快捷、簡單、價廉、高效、牢固且安全(quick,easy,cheap,effective,rugged,and safe,QuEChERS)的方法進行TLC-SERS檢測火鍋調味品中罌粟果皮的新方法。在這項研究中(圖5)，通過檢測罌粟堿和諾斯卡品間接檢測火鍋調味品中的罌粟果皮，并且對QuEChERS方法進行TLC-SERS檢測的可行性進行了評估。通過支持向量機(support vector machine,SVA)，使用導數光譜減少QuEChERS過程對TLC-SERS產生的干擾。更精準地對火鍋調味品中諾斯卡品和罌粟堿的含量進行定量分析研究。采用這種方法，能夠快速有效地對復雜基質中的分析物進行檢測。Tan等[27]，基于支持向量回歸的TLC-SERS聯用技術的機器學習分析方法，可以準確、高效、靈敏地對海鮮中組胺進行現場定量檢測，提高了食品安全性。食品安全問題一直以來都是引人關注焦點，特別是對于有害物質含量的檢測是研究者想迫切解決的一個問題。通過選用不同的固定相材料來提升固定相的檢測性能以及結合更多的數據處理方法來促進聯用技術的檢測速度和檢測效果。

圖5 QuEChERS與TLC-SERS結合用于檢測罌粟堿和諾斯卡品的示意圖[35]Fig.5 Schematic illustration of the QuEChERS combined with TLC-SERS for detection of papaverine and nascapine[35]

3.3 TLC-SERS在中草藥中的應用

中草藥的治療周期長且成分較為復雜，導致一些不法分子為了增強中草藥的效果，在其中添加一些化學藥物成分，從而達到增強藥效的目的。由于中草藥成分和含量，常規的檢測儀器基本上無法對其進行一個準確的界定，Zhu等[36]采用TLC-SERS聯用技術對降壓藥中的非法添加的化學成分進行了快速檢測，利用TLC對含有添加劑的中草藥進行簡單的分離，在結合SERS技術對薄層色譜板上分離的物質進行檢測，通過對展開體系和金屬溶膠的優化，建立了可用于中草藥中非法添加化學成分的檢測方法。實現了降壓藥類中草藥中非法添加化學成分的快速檢測。在植物膳食纖維摻雜劑的研究中(圖6)，合成了適用于親水性和疏水性分析物相對通用的銀溶膠。并進一步對銀溶膠制備工藝進行了優化，即在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中制備銀溶膠，通過比較DMF和聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)制得的銀膠體的SERS性能，發現DMG 2∶1(m/m)銀膠體具有最佳的增強效果，同時所制備的銀溶膠可以存儲90天且增強效果不會發生明顯衰減變化。此外，該研究成功地將這種新型DMF 2∶1膠體與TLC-SERS方法結合起來，用于具有降脂或止咳鎮咳作用的真實植物膳食纖維樣品的檢測。結果表明，使用TLC-SERS聯用技術與新合成的這種快速響應和高度穩定的非水溶膠的結合，將為現場快速檢測大量的樣品提供廣闊的前景。Gu等[37]，提出了一種基于TLC-SERS聯用技術快速分析的方法。通過研究黃連中四種生物堿的檢測對TLC-SERS聯用的方法進行了預估，其檢出限比在254 nm紫外燈下的直接觀察法低約1～2個數量級?；谶@些發現，對傳統中草藥香蒲中未知化合物進行預測并首次發現了香根草正丁醇提取物中的兩種痕量生物堿(小檗堿和黃連堿)，此外，通過體外實驗研究表明，BER可以通過以濃度依賴的方式誘導細胞周期停滯來有效降低人神經膠質瘤U87細胞的生存能力，這一發現將為某些疾病的治療提供極大的幫助。中草藥的研究，對于一些常規檢測儀器在定量和組分分析方面面臨著很大的挑戰，前處理復雜、儀器價格昂貴以及不便于現場檢測都是部分大型儀器所面臨的問題。然而，TLC-SERS聯用技術解決了前處理、價格以及現場檢測的問題。此外，通過對金屬溶膠的優化，該技術已經滿足了親水性與疏水性物質的檢測需求，同時，在新藥物成分的研究方面也取得了很大的進展。

圖6 用于檢測BDS中親水性和疏水性摻雜物的TLC-SERS的示意圖[36]Fig.6 Schematic illustration of TLC-SERS for detection of hydrophilic and hydrophobic adulterants in BDS[36]

3.4 TLC-SERS在生物醫學的應用

疾病的早期快速診斷，在很大程度上控制了人們患某種疾病的可能性。Cimpoiu等[38]，通過TLC-SERS聯用的技術對藥物和食物進行了檢測，檢測到八種親水性維生素。在色譜分離過程中，經過多次展板就能夠對重疊的斑點進行有效識別，該技術的充分運用，對腳氣、貧血、唇干裂方面疾病的預防做出了一定的貢獻。有報道[39]采用一種具有核殼結構SERS與磁性的納米粒子相結合，然后通過對人體乳腺癌細胞中一種特殊的抗體和標記物進行修飾，使其更好地與癌細胞表面吸附，利用外加磁場的作用對癌細胞進行分離檢測。Kong等[16,40]采用硅藻土薄層色譜板作為固定相對血漿中的苯乙胺進行分離，再結合SERS進行檢測，其檢測效果是商業硅膠板的10倍，最低檢測限低至0.01 mg·mL-1(m/v)，有效地檢測出生物堿在血漿中的含量，該研究通過對血漿中苯乙胺的測定，將為抑郁癥患者的治療提供快速診斷治療的最佳時機[圖7(a—f)]。此外，該研究小組利用高度多孔的光子晶體生物二氧化硅通道組成的微流體硅藻土分析設備(Microfluidic diatomite analytical devices,μDADs)對人體血漿中的可卡因進行分離檢測，其中可卡因的最低檢測限低至10 μg·L-1(m/v)。該器件可以同時執行芯片多通道分離，從復雜的生物流體樣品中分離小分子，通過SERS光譜進行定性定量檢測，該技術可以為臨床即時診斷(POCT)和生物傳感提供新的檢測手段。Lucotti等[41]提出了一種檢測阿撲嗎啡的方法，只需在二氧化硅薄層色譜基質上滴加含有阿撲嗎啡的血漿并滴加適當的銀溶膠，通過SERS技術進行檢測，檢測到的SERS信號揭示了血漿中阿撲嗎啡的存在。此外，根據藥物分子與銀溶膠的相互作用，提出了一種密度泛函理論(D-ensity functional theory,DFT)模型，解釋了阿撲嗎啡的主要SERS特征，更高效地為帕金森氏患者的診治提供幫助。生物醫學一直都是一個重要的研究領域，已經存在很多儀器應用于疾病快速診斷。然而，TLC-SERS技術也具有明顯的優點，通過TLC對人體中成分復雜的血漿進行分離，然后，結合優化后的SERS基底已經實現了一些疾病的快速診斷。

圖7 用作SERS的金溶膠(a)和硅藻土TLC板的掃描電鏡圖(b)，TLC分離后硅膠板(c)和硅藻土板(d)的碘顯圖片，來自不同濃度的血漿中的PEA在硅膠板(e)和硅藻土板(f)分離的SERS譜圖[16]Fig.7 SEM image of Au NPs used for SERS (a) and diatomite TLC plate (b),photo of silica gel (c) and diatomite (d) plate after TLC separation of iodine colorimetry,SERS spectra of PEA separated by silica gel plate (e) and diatomite plate (f) from plasma at different concentrations[16]

4 展 望

TLC-SERS技術的出現及應用，實現了對于混合物體系中待測物的快速分離及靈敏檢測。該聯用技術具有操作簡單、快速及靈敏等優點，已經在環境、食品、中草藥等方面得到廣泛應用。目前，通過改變SERS的基底和薄層色譜板的材料已經實現了對于痕量物質的靈敏檢測。相對一些大型儀器而言，TLC-SERS聯用技術在一定程度上實現了商品化和小型化，對于樣品前處理的過程要求簡單，可以實現對樣品進行無損檢測。但是，在如何制備均勻、穩定性好以及可重復性的活性基底方面仍然存在不足，需要對其進行不斷完善。根據市場的需求可以預測到，TLC-SERS技術在儀器化及小型化方面將會有廣闊的發展空間，相信TLC-SERS技術將成為SERS光譜中的重要發展方向之一。