基于硒化鋅薄膜法的食源性致病菌原位紅外光譜檢測

劉艷艷，陶寧萍,2,3，王錫昌,2,3，盧 瑛,2,3*，許長華,2,3*

1.上海海洋大學食品學院，上海 201306 2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306 3.國家淡水水產品加工技術研發分中心(上海)，上海 201306

引 言

食源性致病菌可以直接或間接地污染食品和水源，導致人類腸道傳染病或禽畜傳染病的流行，是引起食品安全問題的重要來源。美國疾病控制中心報道顯示，美國平均每年約有3 000人死于食源性致病菌所引發的疾病[1]。近年來，我國由微生物感染引起的疾患發病率高達61.92%，其中主要是大腸桿菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌等[2]。目前，食源性致病菌常用的檢測方法包括傳統生化方法、分子生物學方法、免疫學方法、生物傳感器技術等方法[3]。但這些方法往往步驟繁瑣、耗時耗力、有的需要專業人員，儀器試劑費用高，難以在常規實驗室廣泛應用。相反，紅外光譜技術可以反映整個細胞組分的整體信息，相比其他方法更加快速、無損、成本低且靈敏度高，受到眾多研究者的關注[4]。

溴化鉀壓片法是比較傳統且至今最為常用的固體制樣方法，其在致病菌的紅外檢測中已有大量報道。楊麗君等[5]以大腸桿菌為例，探討了不同的細菌濃度和培養時間以及是否加熱滅活等不同的前處理方式對光譜特征的影響。結果表明，統一的樣品前處理是決定檢測是否成功的關鍵。硒化鋅薄膜法是利用硒化鋅窗片作為載體，將菌液進行簡單預處理后滴加至硒化鋅窗片中央，低溫烘干后可直接進行紅外檢測的一種前處理方法。王靜[6]等利用硒化鋅薄膜法對兩株不同來源的大腸桿菌進行紅外檢測，并對所采集的光譜進行主成分分析和層次聚類分析。結果表明紅外光譜結合化學計量學可以區分不同來源的同種細菌，但該研究并未對硒化鋅薄膜法和常規溴化鉀壓片法進行比較分析，硒化鋅薄膜法的準確性與優勢并未得到揭示。以上研究均說明樣品前處理是保證紅外檢測質量的關鍵，因此，尋找一種更加快速、合適的前處理方式仍為目前研究的熱點。本研究分別采用硒化鋅薄膜法和常規溴化鉀壓片法，對四種食源性致病菌(大腸桿菌DH5α、沙門氏菌CMCC 50041、霍亂弧菌SH04、金黃色葡萄球菌SH10)進行原位紅外光譜整體檢測，并對所得圖譜進行詳細對比分析，為更加快速精確的致病菌檢測提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

0.9%生理鹽水(NaCl：分析純；國藥集團化學試劑有限公司)、超純水(18.2 MΩ·cm)、溴化鉀(光譜純；自貢三川實業有限公司)、硒化鋅窗片(直徑12 mm，厚度1 mm；天津博天勝達科技發展有限公司)、TG16-WS型離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)、TDZ5-WS小型臺式離心機(上海年悅儀器有限公司)、DW-86L626立式超低溫保存箱(-80 ℃；青島海爾特種電器有限公司)、GHP-9270隔水式恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)、ZQZY-70B振蕩培養箱(上海知楚儀器有限公司)、WH-2型渦旋混合儀(成都一科儀器設備有限公司)、FD-80型真空冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司)、DHG-9140A型鼓風干燥箱(上?；厶﹥x器制造有限公司)、DF-4型壓片機(天津市港東科技發展有限公司)、紅外光譜(FT-IR)儀(英國PerkinElmer公司，配置DTGS檢測器)。

1.2 菌種與培養基

大腸桿菌DH5α (EscherichiacoliDH5α,E.coliDH5α)、沙門氏菌CMCC 50041 (SalmonellaenteritidisCMCC 50041,S.enteritidisCMCC 50041)、霍亂弧菌SH04 (VibriocholeraeSH04,V.choleraeSH04)、金黃色葡萄球菌SH10 (StaphylococcusaureusSH10,S.aureusSH10)。以上菌種均來自上海海洋大學食品學院微生物重點實驗室；菌株用25%甘油保存于-80 ℃冰箱中備用；LB瓊脂培養基(北京陸橋生物技術有限公司)；胰蛋白胨大豆肉湯(TSB，北京奧博星生物技術有限責任公司)。

1.3 樣品的制備及光譜采集

將保存于-80 ℃冰箱的菌株取出，用無菌接種環挑取一環劃線至LB固體培養基，并于37 ℃恒溫培養箱中培養16 h，挑取單菌落至盛有10 mL TSB的培養基，并于37 ℃恒溫震蕩培養箱中培養5 h左右，使其處于對數期，濃度約為108～109CFU·mL-1；分別取5和1 mL菌液于10和2 mL的離心管，8 000 r·min-1，20 ℃，離心4 min并除去上清液，用0.9%生理鹽水清洗一次，超純水清洗兩次(離心條件同上)，其中5 mL菌液除上清后置于真空冷凍干燥機中凍干2 d備用，另一份1 mL菌液去上清，重懸于100 μL的超純水中備用[7]。

取1～1.5 mg凍干的菌體粉末與約100 mg溴化鉀晶體充分混合研磨，將研磨好的粉末倒入壓片模具中，施加壓力(約8 t 左右)，1 min后卸載壓力，即可得到半透明樣品薄片，對薄片進行光譜采集[8]；另吸取10 μL菌液于硒化鋅窗片中央，并置于48 ℃干燥箱，烘干40 min左右，至呈現干燥菌斑，取出后置于紅外光譜儀樣品艙內進行光譜采集。分辨率4 cm-1；掃描范圍4 000～600 cm-1；掃描次數：32次；掃描過程中扣除CO2和H2O的干擾。

1.4 數據預處理

為降低噪音并提高圖譜“表觀分辨率”，利用Spectrum 10TM(PerkinElmer)對所采集的光譜進行基線校正、平滑、歸一化等處理，并利用二階13點SavitskyGolay算法計算二階導數圖，每個樣品做六個平行，求平均光譜，并在不同時間段重復測試三次[9-11]。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理對比分析

硒化鋅薄膜法與溴化鉀壓片法的前處理流程圖(圖1)顯示：兩種方法均需要對菌株進行活化純培養及離心去除培養基等處理。此外，硒化鋅薄膜法僅需要對菌體沉淀進行重懸(1 min)、低溫烘干(48 ℃)即可進行紅外檢測，共計耗時約50 min。而溴化鉀壓片法則需要對備用菌株進行低溫預凍(>5 h)、凍干(2 d左右)以及壓片處理才可進行檢測，共計耗時約54 h。結果表明，與溴化鉀壓片法相比硒化鋅薄膜法不僅可以簡化前處理流程，大大節省時間，且所需樣品量少(10 μL)，對樣品不須進行研磨等物理破壞，保持了樣品的完整性，有益于檢測結果的準確性。

圖1 硒化鋅薄膜法與溴化鉀壓片法(含前處理)流程圖Fig.1 Diagram (including sample pretreatment) of ZnSe film transmission and KBr pressed pellet method

2.2 整體紅外宏觀指紋圖譜對比分析

圖2 基于硒化鋅薄膜法的四種食源性致病菌整體紅外宏觀指紋圖譜Fig.2 Integrated infrared macroscopic fingerprint of four foodborne pathogens based on ZnSe film transmission method

表1 四種食源性致病菌的紅外特征譜帶指認Table 1 Major spectral band assignments for Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) of four foodborne pathogens

圖3 基于硒化鋅薄膜法與溴化鉀壓片法的四種食源性致病菌整體紅外宏觀指紋對比圖(a):大腸桿菌DH5α;(b):沙門氏菌CMCC 50041;(c):霍亂弧菌SH04;(d):金黃色葡萄球菌SH10Fig.3 Comparison of IR spectra in four foodborne pathogens based on ZnSe film transmission and KBr pressed pellet method(a)：E.coli DH5α；(b)：S.enteritidis CMCC 50041；(c)：V.cholerae SH04；(d)：S.aureus SH10

四種食源性致病菌利用硒化鋅薄膜法與溴化鉀壓片法的全波段(4 000～600 cm-1)紅外譜圖(圖3)基本一致，特征峰的位置、強度以及峰形總體沒有明顯差異。然而，硒化鋅薄膜法的特征峰在4 000～2 500 cm-1更為尖銳，較溴化鉀壓片法更為明顯。

2.3 二階導數整體紅外宏觀指紋圖譜

圖4 大腸桿菌DH5α二階導數整體紅外宏觀指紋圖譜Fig.4 SD-IR spectra of E.coli DH5α in the region of 4 000～600 cm-1

圖5 基于硒化鋅薄膜法與溴化鉀壓片法的四種食源性致病菌二階導數紅外宏觀指紋對比圖(1 500～900 cm-1)(a)：大腸桿菌DH5α；(b)：沙門氏菌CMCC 50041；(c)：霍亂弧菌SH04；(d)：金黃色葡萄球菌SH10Fig.5 Comparison of SD-IR comparison spectra in four foodborne pathogens based on ZnSe film transmission and KBr pressed pellet method (1 500～900 cm-1)(a)：E.coli DH5α；(b)：S.enteritidis CMCC 50041；(c)：V.cholerae SH04；(d)：S.aureus SH10

表2 硒化鋅薄膜法與溴化鉀壓片法二階導數圖譜(1 500～900 cm-1)特征峰比較Table 2 Comparison of characteristic peak in SD-IR spectra (1 500～900 cm-1) based on ZnSe film transmission and KBr pressed pellet method

3 結 論

四種食源性致病菌的硒化鋅薄膜法與溴化鉀壓片法對比分析表明：薄膜法的綜合效果更好。其中，在前處理流程中，硒化鋅薄膜法不僅大幅度簡化操作步驟，縮短處理時間(共計50 min以內)，且不需凍干與研磨，極大降低對樣品的破壞程度以及外界引入的干擾。此外，兩種方法所測得的紅外原始圖譜及二階導數圖譜的詳細比對分析表明：硒化鋅薄膜法所測得的圖譜信噪比較好且分辨率高，信息豐富穩定。因此，基于硒化鋅薄膜法的食源性致病菌原位紅外光譜整體檢測技術對于快速、無損的致病菌紅外檢測具有重要的應用價值。