甲醛功能化聚乙烯亞胺/曙紅Y比率熒光法測定六偏磷酸鈉

楊傳孝，龔未彬，唐 璠，孫向英

華僑大學材料科學與工程學院，福建 廈門 361021

引 言

多聚磷酸根、偏磷酸根、正磷酸根及核苷酸等均含磷酸根陰離子，其中核苷酸是生命體組成的重要成分并參與生命過程，多聚磷酸根、偏磷酸根、正磷酸根等是重要的化工原料，六偏磷酸鈉是常用的食品添加劑。因此，含磷酸根陰離子的檢測具有十分重要的現實意義[1-2]。食品級六偏磷酸鈉(sodium hexametaphosphate,SHMP)是一種多聚磷酸鹽，是一種具有環狀和鏈狀結構的混合物，對二價金屬離子 (如Ca2+) 具有較好的結合能力，其鏈狀結構能保持其pH在一個穩定的范圍。在食品、乳品、飲料及牙膏產品中加入SHMP，可以提高產品的持水性、結著性、防止脂肪氧化，提高果汁飲料的出汁率和黏度，抑制維生素C的分解、穩定食品中的天然色素及色澤、保護牙齒免遭酸性飲料的侵蝕等[3-4]；在納米材料的制備過程中加入多聚磷酸鹽可以提高納米粒子的穩定性及發光性能[5-6]。然而即使是食品級的SHMP，其中也含有微量的重金屬及氟化物，過量添加會破壞營養元素，嚴重危害人體的健康,我國對各類食品中六偏磷酸鈉的允許用量做了明確的規定[7](茶飲料中SHMP的最大使用量為0.5 g·kg-1)，因此建立一種快速檢測食品、飲料中SHMP含量的方法具有重要意義。目前,測定食品中磷酸鹽添加劑的方法有重量法、原子吸收光度法、離子色譜法及分光光度法等。其中重量法、原子吸收光度法、離子色譜法存在使用試劑種類多、操作繁瑣費時等缺點。而熒光[8-9]檢測六偏磷酸鈉具有較高靈敏度和選擇性。

聚乙烯亞胺(polyethyleneimine,PEI)是一種水溶性陽離子聚合物，具有線狀和支鏈狀兩種結構形式。其結構中富含大量胺基，可通過氫鍵、配位、靜電作用等與其他物質結合。Wen[10]等研究表明PEI能與曙紅(eosin Y,EY)通過靜電作用結合，導致EY的熒光顯著猝滅，當十二烷基硫酸鈉存在時EY的熒光又得到恢復。在微波輔助條件下甲醛與PEI快速作用，生成物在紫外光照射下發藍色熒光。本研究表明該甲醛功能化的聚乙烯亞胺(formaldehyde functionalized polyethyleneimine,FPEI)保留了PEI的一些性質，其表面殘留的胺基仍能與EY通過靜電作用結合形成基態復合物，導致EY的熒光顯著猝滅。在酸性介質中，SHMP可以阻礙EY與 FPEI的結合，從而抑制EY熒光強度的降低，而FPEI本身的熒光強度變化不大，可以作為內標物質。由此構筑比率熒光體系(圖1)，構建EY/FPEI比率熒光探針，并成功用于飲料中 SHMP 的檢測。該方法選擇性好、操作簡單、快速，測定結果令人滿意。

圖1 FPEI/EY與SHMP作用示意圖Fig.1 Scheme of the reaction between FPEI/EY and SHMP

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Cary Edipse型熒光分光光度計，安捷倫科技(中國)有限公司；Nicolet Magna IR560型傅里葉變換紅外光譜儀(美國Nicolet公司)，H-7650型透射電鏡(日本Hitachi公司)，UV-2800H紫外可見分光光度計(日本Shimadzu公司)，Milli-Q超純水(美國Millipore公司)，WX-4000微波消解儀(上海屹堯儀器科技發展有限公司)，WFH手提式紫外分析儀(杭州齊威儀器有限公司)。

聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine,PEI,分子量為10 000)，阿拉丁試劑有限公司；甲醛溶液(37.0%～40.0%,西隴化工股份有限公司)；曙紅(Eosin Y,EY)，西隴化工股份有限公司，溶液濃度為1.0×10-4mol·L-1；六偏磷酸鈉(sodium hexametaphoshate,SHMP)，廣東光華化學廠有限公司，溶液濃度為1.0×10-5mol·L-1。試劑均為AR級，實驗使用超純水,電阻為18.2 MΩ。

1.2 方法

準確移取聚乙烯亞胺溶液 (8.539×10-3g·mL-1)10 mL，甲醛溶液1.0 mL，乙酸溶液0.4 mL加去離子水至15 mL。在溫度120 ℃，壓力10 atm，功率600 W的條件下，微波消解30 s獲得FPEI備用。

將FPEI原液稀釋200倍制備操作溶液。在10 mL比色試管中依次加入0.5 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH 3.93)，1.0 mL FPEI操作溶液，適量的SHMP標準溶液和樣品溶液，0.2 mL濃度為 1.0×10-4mol·L-1的EY，用超純水定容至5.0 mL。于Cary Edipse熒光分光光度計上，340 nm光激發，掃描360～650 nm 波長范圍的熒光發射光譜,并記錄位于470和540 nm處的熒光強度。直接把樣品置于365 nm紫外燈下，用數碼相機拍攝熒光成像。

2 結果與討論

2.1 FPEI/EY與六偏磷酸鈉作用的光譜特征

如圖2所示，在微波輔助條件下，甲醛功能化的PEI在350 nm處出現新的紫外吸收峰，其電鏡圖表明FPEI具有明顯的網狀結構(圖2，插圖)。激發波長在320～420 nm范圍內，隨著激發波長的增加FPEI熒光發射峰的峰位逐漸紅移，在激發波長為340 nm時，FPEI的熒光激發峰位于470 nm處，紫外燈下發藍色熒光，在FPEI相同激發條件下，EY的熒光發射峰位于540 nm處[圖3(a，線2)]。與FPEI和EY的熒光發射光譜相比，FPEI/EY比率熒光發射光譜[圖3(a，線3)]中540 nm處EY的熒光發射強度顯著降低，而470 nm處FPEI的熒光強度卻變化不大，此時熒光顏色以FPEI為主。

圖2 FPEI的紫外-可見吸收光譜和在不同激光波長下的熒光發射光譜Fig.2 UV-Vis absorption and Fluorescence emission spectra of FPEI under different excitation wavelengths

如圖3(b)所示，隨著SHMP的量增加，FPEI/EY比率熒光體系在540 nm處熒光強度逐漸增加，而470 nm處的熒光強度卻基本不變，540和470 nm處熒光強度的比值(F540/F470)與SHMP的濃度呈較好的線性關系[圖3(b，內插圖)]。在紫外燈照射下，可以明顯看出，隨著SHMP的量增加體系熒光由藍色逐漸變為綠色。

圖3 PFEI/EY光譜(a)與SHMP作用(b)的熒光光譜濃度:EY：4.0 μmol·L-1;FPEI,1.0 mL;pH 3.93;λex=340 nmFig.3 Fluorescence spectra of the reaction between FPEI/EY (a) and SHMP (b)Concentration:EY：4.0 μmol·L-1;FPEI,1.0 mL;pH 3.93;λex=340 nm

2.2 FPEI/EY與六偏磷酸鈉的作用機理

曙紅 Y(H2L)在水溶液中的離解常數為pKa1=2.6和pKa2=3.6，可以預測當pH>3.6時EY主要存在形式是L2-。而FPEI的紅外吸收光譜[圖4(a)]保留了N—H的伸縮振動(波數為3 349和3 278 cm-1)、N—H的面內彎曲振動(波數為1 580 cm-1)、—CH2—的伸縮振動(波數為2 933和2 813 cm-1)、C—N的伸縮振動(波數為1 042和1 105 cm-1)等PEI的紅外特征峰，同時在1 662 cm-1產生了新峰，表明甲醛的羰基基團與—NH2之間發生了Schiff堿反應，進而形成具有網狀結構的化合物。在酸性條件下，FPEI表面殘留的—NH2基和—NH基質子化，通過靜電引力與EY的生色團和熒光團上帶負電荷的羥基氧原子作用，形成了FPEI/EY基態復合物導致EY熒光猝滅，遵從靜態猝滅機理。加入SHMP前后EY吸收光譜的變化可以證明FPEI/EY基態復合物的形成，如圖4(b)所示。另一方面，甲醛與PEI交聯生成的FPEI具有網狀結構且具有熒光特性，這種網狀結構結構可以有效減少EY 的稠環芳烴和 FPEI分子內烷基鏈的疏水作用，使得EY只存在于FPEI分子的表面，因此FPEI/EY基態復合物的形成對FPEI的熒光發射影響較小。當有SHMP存在時，由于SHMP與FPEI表面質子化氨基的靜電作用強于EY，因而SHMP可以阻止FPEI/EY基態復合物的形成，致使EY吸光度[圖4(b)]及熒光[圖3(b)]逐漸恢復。

圖4 FPEI的紅外吸收光譜(a)及FPEI/EY與SHMP作用的吸收光譜(b)Fig.4 FTIR spectra of FPEI (a) and absorption spectra of the reaction between FPEI/EY and SHMP (b)

2.3 條件優化

2.3.1 激發波長的選擇

如圖5所示，FPEI和EY的熒光發射強度與激發光波長有關，FPEI的最大激發峰位于350 nm處。在激發波長位于320～340 nm時，540 nm處EY的熒光強度基本不變。當激發波長大于340 nm時，540 nm處EY的熒光強度迅速降低?？紤]到FPEI/EY比率熒光體系熒光比色的需要，本研究選擇激發光波長為340 nm。

圖5 激發光波長對熒光強度的影響FPEI：1.0 mL;EY：4 μmol·L-1;pH 3.93Fig.5 Effect of excitation wavelength on the fluorescence intensityFPEI：1.0 mL;EY：4 μmol·L-1;pH 3.93

2.3.2 溶液pH的影響

pH值對FPEI/EY復合物470 nm處的熒光強度基本沒有影響，但對于540 nm處的熒光強度影響較大，隨著pH值的不斷增加，熒光強度顯著增強，當pH值大于5.5后趨于穩定。如圖6所示，加入SHMP前后，pH對于FPEI/EY復合物540和470 nm處的熒光強度的比值(F540/F470)的影響基本一致，均隨pH的增加逐漸增加。但是，加入SHMP前后F540/F470增加的程度(ΔF540/F470)卻隨pH的增加呈現先增加后降低的趨勢，pH在3.9左右時體系F540/470增強的程度達到最大，因此本研究用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液控制體系的pH為3.90左右。

圖6 pH對FPEI/EY與SHMP作用的影響FPEI：1.0 mL;EY：4 μmol·L-1; SHMP：4 μmol·L-1;λex=340 nmFig.6 Effect of pH on the reaction between FPEI/EY and SHMPFPEI：1.0 mL;EY：4 μmol·L-1; SHMP：4 μmol·L-1;λex=340 nm

2.3.3 甲醛加入量的影響

FPEI表面殘留的氨基對FPEI/EY基態復合物的形成有較大的影響，如圖7所示。隨著甲醛(37.0%～40.0%)加入量的增加，FPEI/EY復合物位于540 nm處的熒光強度有逐漸增強的趨勢，當甲醛加量大于2.0 mL時熒光強度又緩慢降低。研究表明540 nm處的熒光增強與SHMP間的線性范圍及靈敏度均隨著甲醛加入量的增加而增加，當甲醛(37.0%～40.0%)加入量大于1.0 mL時其線性范圍及靈敏度又逐漸減少。這充分說明了甲醛越多FPEI的網狀結構越多、其表面的活性基團減少，FPEI與EY間的疏水作用和靜電作用減弱，有利于FPEI/EY復合物與SHMP作用。但是甲醛加入量太多FPEI表面的質子化氨基太少，又會導致FPEI表面結合的EY的量減少，因而線性范圍及靈敏度逐漸減少。本研究用1.0 mL甲醛(37.0%～40.0%)合成FPEI。

圖7 甲醛對SHMP增強EY熒光的影響FPEI：1.0 mL;EY：4 μmol·L-1; SHMP：2.4 μmol·L-1;pH 3.93Fig.7 Effect of formaldehyde on the fluorescence increasing of EY by SHMPFPEI：1.0 mL;EY：4 μmol·L-1; SHMP：2.4 μmol·L-1;pH 3.93

2.3.4 EY加入量的影響

考察了一定量的FPEI與不同濃度的EY形成的FPEI/EY復合物與SHMP作用，如圖8和表1所示。加SHMP前后FPEI/EY復合物F540/F470值隨著EY濃度的變化趨勢一致，即F540/F470值隨著EY濃度的增大而增加(圖8)。表1的實驗結果表明隨著EY濃度的增大FPEI/EY復合物的比率熒光與SHMP作用的線性范圍有逐漸增大的趨勢。當EY濃度小于4.0 μmol·L-1時，隨著EY濃度的增大FPEI/EY比率熒光測定SHMP的靈敏度(線性擬合曲線的斜率)增加較快，而當EY濃度大于4.0 μmol·L-1時FPEI/EY比率熒光測定SHMP的靈敏度增加變緩。因此，本研究選擇濃度為4.0 μmol·L-1的EY與FPEI作用形成FPEI/EY復合物。

圖8 EY對FPEI/EY與SHMP作用的影響FPEI：1.0 mL;EY：4 μmol·L-1;SHMP：2.4 μmol·L-1; λex=340 nm；pH 3.93Fig.8 Effect of EY on the reaction between FPEI/EY and SHMPFPEI：1.0 mL;EY：4 μmol·L-1;SHMP：2.4 μmol·L-1; λex=340 nm；pH 3.93

表1 EY加入量對分析測定參數的影響Table 1 Effect of EY on analytical parameters for determination

2.4 共存物質的干擾

2.5 標準曲線及樣品分析

在上述最優條件下，考察了FPEI/EY復合物與不同濃度SHMP作用的線性關系，如圖9和表2所示。與540 nm處的熒光增強與SHMP濃度的線性關系相比較，可以看出比率熒光法(F540/F470)獲得的線性相關系數(R2)、線性范圍和檢出限均有明顯提高，這是因為比率熒光法可以有效避免光源不穩定等因素對熒光強度的影響，可有效提高測定的準確度。將三種飲料(茉莉清茶、冰紅茶、冰綠茶)稀釋10倍后用本方法進行測定，結果如表3所示。對樣品進行了加標回收實驗，回收率在95.0%～108.3%之間，說明運用比率熒光法測定飲料中六偏磷酸鈉的結果滿意。

圖9 540 nm熒光強度及F540/F470與不同濃度SHMP間的關系FPEI：1.0 mL;pH 3.93,λex=340 nmFig.9 Plots of fluorescence intensity at 540 nm and F540/F470 via the concentrations of SHMPFPEI：1.0 mL;pH 3.93,λex=340 nm

表2 分析測定參數Table 2 Analytical parameters for determination

表3 飲料中SHMP的測定結果Table 3 Results for the determination of SHMP in drink samples

3 結 論

在微波輔助條件下，成功合成了發藍色熒光的 FPEI，基于FPEI表面氨基與EY的生色基團和熒光基團作用形成FPEI/EY基態復合物，發展了一種FPEI/EY雙熒光體系比率熒光法測定SHMP的新方法，該法具有靈敏度高、反應快、操作簡便等優點，可用于實際飲料中 SHMP的分析檢測。