不同比例有機無機肥配施土壤腐殖質組分的光譜學特征

仝利紅，祝 凌，趙 楠，呂貽忠*，柳夏艷，蔣 珊，李應心

1.中國農業大學土地科學與技術學院，北京 100193 2.同濟大學環境科學與工程學院，上海 200092 3.中山大學環境科學與工程學院，廣東 廣州 510275

引 言

土壤有機質是土壤最重要的碳(C)庫，其含量變化不僅影響土壤質量，而且影響整個大氣系統內C循環，因此提高土壤有機質含量對于提高土壤肥力和生產力、減緩溫室效應具有深遠意義[1]。土壤腐殖質是土壤有機質的主體部分，它是將來源于動物、植物、微生物等前體材料在微生物作用下經過一系列生物化學反應，形成了具有多相分布且結構復雜，含有羧基、羥基、酚基和醌基等官能團[2]的一類高分子化合物。由于前體材料類型及環境條件不同，所以土壤中形成的腐殖質具有“特異性”。張玉蘭等研究表明，長期施用有機肥或氮磷鉀混合施用使土壤腐殖質中小分子糖類物質減少，芳香類物質增加。竇森也指出不同環境條件下形成腐殖質的結構具有顯著差異[3]。

土壤腐殖質包括胡敏酸(HA)、富里酸(FA)和胡敏素(HU)。HA和FA統稱為腐殖酸，是腐殖質中的活性部分，具有較高的生物可利用性，HA和FA的分子結構之間差異顯著，且在微生物作用下可相互轉化，其物質組成和結構變化直接影響土壤的碳、氮循環[4]。Guo[5]研究表明HA和FA由于苯酚、羧酸、羥基等各種官能團的存在，從而促進了植物生長，有利于土壤養分和水分的保持，并且提高了土壤抑制病蟲害的能力。因此，研究土壤中有機質的轉化過程需要對其腐殖質組分的組成和結構進行研究分析，而單一的腐殖質組分結構的變化可能無法真實的反映有機質的轉化機制。不同的施肥方式必然對土壤有機質的影響不同，然而目前關于施肥處理對土壤腐殖質結構的研究主要集中在單一組分結構的研究。

本研究以河北曲周長期定位試驗為基礎，以不同比例有機無機肥三種施肥方式為研究對象，采用元素分析、紅外光譜和固態13CNMR三種分析方法研究不同比例有機無機肥混施對華北地區土壤HA和FA結構的影響，研究分析不同施肥處理土壤腐殖質組分的性質和結構差異，判斷土壤有機質的演變程度，從而為土壤有機碳轉化機制和有機培肥土壤提供理論基礎。

1 實驗部分

1.1 試驗地點及田間試驗設計

試驗地點在中國農業大學曲周長期定位實驗站(36°52′N，115°01′E)內，實驗站于2002年3月建立，位于河北省邯鄲市曲周縣北部，屬溫帶半濕潤季風氣候區，年均降雨量604 mm。試驗在進行蔬菜生產的日光溫室中開展，日光溫室采用拱圓式的鋼架結構，長52 m，寬7 m，占地面積約0.04 hm2。溫室土壤為鹽化潮褐土，砂粒含量54.11%，粉粒含量28.45%，粘粒含量17.44%。試驗前土壤有機質16.94 g·kg-1，全氮1.24 g·kg-1，全磷1.61 g·kg-1，pH為7.68。

試驗設計3個處理，共3個溫室大棚，每個大棚內包括3次重復。2018年溫室內采用番茄-芹菜輪作。試驗處理如下：(1)F1：化肥為主(70%)，少量施用有機肥(30%)，(2)F2：50%化肥+50%有機肥，(3)F3：100%有機肥。施肥量為(1)F1，7 t·hm-1·year-1化學肥料，26.7 t·hm-1·year-1的生物有機肥，(2)F2：3.8 t·hm-1·year-1化學肥料，52.3 t·hm-1·year-1的生物有機肥，(3)F3：105 t·hm-1·year-1生物有機肥。供試肥料：試驗用化肥為尿素(N 46%)、普通過磷酸鈣(P2O512%)，氯化鉀(K2O 50%)。生物有機肥為自制(N 1.21%，P2O50.6%，K2O 1.58%)，其主要原料為牛糞、雞糞、棉仔餅、農作物秸稈等農業廢棄物，經微生物發酵、充分腐熟處理，加工而成。

1.2 樣品采集

試驗地于2018年5月在大棚內進行土壤樣品采集，取樣深度為0～20 cm。取樣時按S 型路線進行取樣，每7個點為一個混合樣。土樣取回后，經風干、研磨和過篩后進行測定。

1.3 方法

1.3.1 腐殖質組分提取及純化

將土壤樣品腐殖質組分進行提取并測定其含量。土壤腐殖質組分的提取方法遵循國際腐殖酸協會(IHSS)的標準方法。取0.25 mm過篩的風干土樣，將0.1 mol·L-1NaOH和0.1 mol·L-1Na2P2O7混合液(pH=13)按照水土比10∶1震蕩、提取24 h后，3 000～4 000轉離心15～20 min，上清液為腐殖酸溶液。收集的上清液使用0.5 mol·L-1H2SO4調節pH為1.0～1.5，靜置過夜，然后離心進行固液分離，溶液即為FA，沉淀為胡敏酸。然后將得到的粗胡敏酸和富里酸分別進行純化并進行紅外光譜測定。將沉淀的HA置于透析袋內透析一周進行HA的純化，以除去可溶性礦物鹽；FA溶液則需要倒入樹脂柱，將溶液通過樹脂柱并收集濾液，此濾液為純化后的FA。最后，將純化后的HA和FA進行冷凍干燥。然后利用重鉻酸鉀氧化法測定HA和FA含量。

1.3.2 元素分析

采用 Vario EL Ⅲ(Hanau,Germany)元素分析儀測定樣品中的C，H和N的含量，O含量通過差減法得到。

1.3.3 紅外光譜測定

將冷凍干燥的土壤腐殖質樣品進行紅外光譜測定。樣品粉碎研細至0.2 μm，然后將微量純樣品放在金剛石上壓平后測試。所用儀器型號為：Nicolet 750 顯微紅外儀。測試范圍為4 000～500 cm-1，檢測器MCT/A，分束器KBr，掃描次數128次，分辨率設為8 cm-1。

1.3.4 核磁共振

采用Bruker AV 300型核磁共振儀測定，運用交叉極化魔角自旋(CP-MAS)技術獲得了固體樣品的13C核磁共振(13C-NMR)譜。13C的共振頻率為75.4 MHz，魔角自旋的頻率為12 kHz，接觸時間為3 ms，循環延遲時間為5 s。積分面積由機器自動給出，各類型碳的相對含量用某化學位移區間面積比占總面積的比值表示。

1.3.5 數據統計分析

采用SPSS 20.統計分析軟件對土壤腐殖質碳組分含量進行方差分析。將紅外光譜和核磁共振數據利用Origin 8.0軟件進行繪圖。紅外光譜數據統一采用Origin 8.0軟件進行歸一化處理。

2 結果與討論

2.1 不同比例有機無機肥配施對土壤腐殖質組分含量的影響

圖1所示，HA和FA含量均在F3處理內最高，分別為11.01和10.51 g·kg-1。與F1相比，F3使HA提高了106.01%，FA提高了180.22%，F2則分別提高了53.55% 和44.70%(圖1)。我們的研究結果表明單施有機肥對于提升腐殖質組分含量優于化肥和有機肥混施。有研究表明有機肥對于提高土壤腐殖質組分含量的效果毋庸置疑[6]。本研究結果與之相同，有機肥顯著提高了土腐殖質組分含量，其中高量有機肥的效果最好。也有研究者認為有機肥與化肥配施對于提高土壤腐殖酸含量優于單施有機肥(見本刊39卷第三期845頁)，這可能與有機肥的數量密切相關。

圖1 不同比例有機無機肥配施土壤HA和FA的含量Fig.1 HA and FA contents of soil under different ratios of organic and inorganic fertilizers

2.2 不同比例有機無機肥配施土壤腐殖質組分的元素分析

土壤胡敏酸(HA)和富里酸(FA)元素組成中C和O的占比最大，其次是H和N，HA中的C含量最高，FA中則O含量最高，并且HA中C、H和N的含量遠高于FA，說明HA的縮合度較高、分子結構較復雜。不同配比的有機無機肥對HA和FA各元素含量及原子比影響不同。F3處理的HA中的C、H和N的含量最高，O含量最低，H/C，O/C和(N+O)/C的比值最低，說明單施有機肥HA中的芳香類物質最多，脂肪烴類物質和羧酸類物質最低。F1處理中C的含量最低，O的含量最高，H/C，O/C和(N+O)/C的比值最高，說明低量有機肥與化肥配施脂肪烴類和羧酸類物質最多(表1)。與F1相比，F2和F3降低了H/C，O/C和(N+O)/C的比值，說明有機肥的施用提高了HA的縮合度，降低了其氧化度和極性。C/N的比值在F2和F3中同樣表現增加的趨勢，并在F2中的值最大，說明有機肥能夠促進HA中含氮化合物的形成，而有機無機肥配施的效果最好。

三種處理中，F2和F3處理提高了FA中C和N的含量，降低了H和O的含量，使FA的H/C，O/C和(N+O)/C的比值下降，而C/N的比值增加，表明了有機肥的施用同樣提高了FA的縮合度而降低了氧化度和極性，促進了含氮化合物的形成，并且在F2處理中尤為明顯(表1)。研究結果表明，有機無機肥混施對于FA結構的影響更加明顯。綜上所述，雖然有機肥的施用提高了HA和FA的縮合度，降低了氧化度和極性，然而不同比例有機無機肥配施對HA和FA的元素含量影響并不相同。

表1 HA和FA各種元素含量和原子比Table 1 Elemental concentration and atom ratio of humic acids and fulvic acid

2.3 不同比例有機無機肥配施土壤腐殖質組分結構的FTIR特征

圖2 不同比例有機無機肥混施土壤HA的紅外光譜Fig.2 IR spectra of HA under different ratios of organic and inorganic fertilizers

圖3 不同比例有機無機肥混施土壤FA的紅外光譜Fig.3 IR spectra of FA under different ratios of organic and inorganic fertilizers

表2 不同比例有機無機肥配施土壤HA和FA紅外光譜主要吸收峰的吸光度比值Table 2 Ratio between main absorbance peaks of IR spectra of HA and FA under different ratios of organic and inorganic fertilizers

2.4 不同比例有機無機肥配施土壤腐殖質組分結構的CPMAS 13C-NMR波譜特征

一般將腐殖質的CPMAS13C-NMR波譜分為5個主要的共振區，分別是烷基C區(δ0～50)、烷氧C區(δ50～110)、芳香C區(δ110～165)、羧基C區(δ165～190)和羰基C區(δ190～230)[7]。圖4為HA的固態CPMAS13C-NMR波譜，不同施肥處理的HA在30 ppm處吸收峰明顯并且在不同處理間的差異較大，30 ppm則代表長鏈烷烴或環烷烴結構中的亞甲基C。HA的烷氧C的峰主要在55 ppm處，歸屬為甲氧基C和碳水化合物C的吸收。芳香C區中，130 ppm主要是被羧基和羧甲基取代的芳香C；150 ppm代表的是酚羥基C。羰基C區中，170 ppm的峰代表的是羧基C。羰基C中，220 ppm處較弱的吸收峰代表的主要是醛基和酮基[8]。三種處理相對比，F2和F3處理提高了HA中烷基C和烷氧基C的含量，降低了芳香C、羧基C和羰基C的含量，從而提高了HA的脂化度而降低了芳化度，特別是在F2處理中烷氧C的含量達到了最高，而芳香C的含量最低(表3)。與F1相比，F3使脂化度提高了3.21%，芳化度降低了6.42%，F2則分別為14.26%和28.54%，說明F2和F3都能提高HA的脂化度，降低其芳化度，但F2處理對于HA官能團的影響更加顯著。

圖4 不同比例有機無機肥配施土壤HA的CPMAS 13C-NMR波譜Fig.4 CPMAS 13C-NMR spectra of HA under different ratios of organic and inorganic fertilizers

FA與HA核磁共振圖譜分區相同，可劃分為5個主要共振區(圖5)。在烷基C區中，20～30 ppm處吸收峰代表了支鏈和短鏈烷基C[9]。烷氧C區中，71 ppm為碳水化合物C的吸收峰。126 ppm(芳香C區)附近主要是被羧基或羧甲基取代的芳香C的吸收峰，176 ppm(羧基C區)代表的是羧酸、酯和酰胺C的吸收峰。羧基C區中，225 ppm較弱的吸收峰主要是酮，醌或乙醛。如表3所示，相較于F1處理，F3處理提高了FA的烷基C、烷氧C和羧基C的含量，降低了芳香C和羰基C的含量，F2處理則增加了烷氧C和羧基C的含量，而降低了烷基C、芳香C和羰基C的含量。在三種處理中，F3和F2處理都提高了FA的脂化度而降低了其芳化度。在F2和F3處理中，脂化度分別提高了2.89%和2.54%，芳化度則分別降低了7.18%和6.30%，說明F3處理對于提高FA的脂化度，降低其芳化度的效果更優。綜上所述，有機肥的施用能夠提高HA和FA的脂化度降低其芳化度，但是不同施用量有機肥土壤HA和FA的形成機制不同。

圖5 不同比例有機無機肥配施土壤FA的CPMAS 13C-NMR波譜Fig.5 CPMAS 13C-NMR spectra of FA under different ratios of organic and inorganic fertilizers

表3 不同比例有機無機肥配施HA和FA 的CPMAS 13C-NMR圖的各官能團面積相對比例Table 3 Intensity distribution in the CPMAS 13C-NMR spectra of HA and FA under different ratios of organic and inorganic fertilizers

3 結 論

有機肥的施用能顯著提高土壤腐殖質組分含量，且施用量越大，含量越高。通過對腐殖質組分多種光譜分析結果表明，不同比例有機無機肥混施中HA和FA的形成機制不同。不同比例有機無機肥混施HA和FA元素含量變化不同。與低量有機肥與化肥混施處理相比，高量有機肥與化肥混施和單施有機肥處理都提高了HA中脂肪族化合物、碳水化合物物質的含量，FA的羧基基團、脂肪基團含量也增加，并且在單施有機肥處理中表現最為顯著；高量有機肥與化肥混施則降低了HA中脂肪烴物質的含量，FA中的碳水化合物則達到最高。13C核磁共振波譜分析顯示，隨著有機肥的施用HA和FA的脂化度增加而芳化度下降，其中HA官能團變化在高量有機肥與化肥混施中更加顯著，FA則在單施有機肥處理中變化更加明顯。綜上所述，有機肥顯著提高了土壤腐殖質組分含量，并且提高了HA和FA的脂化度降低其芳化度，但是不同用量有機肥下HA和FA的形成機制不同。