香蕉貯藏氣體3D熒光表征特征選擇及早期腐敗預警初探

李孟麗，殷 勇，袁云霞，李 欣，劉雪茹

河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023

引 言

香蕉因其易于食用且含有豐富的鉀、鎂等礦物質元素而廣受歡迎，成為世界上進出口貿易額最大的水果之一[1]，同時也是我國南方重要的經濟作物。但是，由于香蕉是典型的呼吸躍變型果實，其經乙烯催熟后即迅速進入黃熟衰老階段，貨架期一般僅有3～5 d[2]。期間主要變化為果實硬度下降、糖度增加、果皮變黃進而出現褐變，嚴重降低品質，造成極大的經濟損失[3]。因此，在香蕉貯藏期間，對其實現腐敗變質的早期預警是十分必要的[4]。

目前研究者對香蕉的腐敗過程的研究多是通過主觀的感官評定或是通過檢測可溶性糖含量、硬度、果皮色澤指數、pH以及相對電導率等理化檢測方法[5]，也有研究者通過高光譜或近紅外技術對香蕉進行品質等級的研究[6]，但這些方法實施起來要么繁瑣、要么需要隨機檢測大量的樣本(如高光譜檢測)，而且因取樣的隨機性與個體差異性不能真正做到對貯藏庫內香蕉整體質量變化的監控。在香蕉貯藏過程中，香蕉品質的變化會引起貯藏室內空氣中的浮游微生物含量及氣體組分的變化。同時，考慮到貯藏室內氣體因擴散而具有一致性的特點，因此通過對貯藏室內的氣體進行熒光檢測，可更加準確反映香蕉在貯藏過程中的品質變化。而目前通過環境變化對香蕉的腐敗進程進行追蹤的研究較少，通過采集具有均勻一致性的貯藏庫氣體來實現香蕉的整體質量監控具有創新性。

三維熒光光譜技術由于其具有較高靈敏度和多組分選擇性，能夠表征豐富的熒光信息，同時具有光譜指紋特性，因而逐漸取代二維熒光光譜技術，在水環境、醫藥、食品等[7]領域得到迅速發展。因此，本研究擬采用三維熒光光譜技術，以香蕉貯藏期間貯藏室內空氣為取樣檢測對象，來實現香蕉貯藏過程中品質的監測。

在香蕉的貯藏過程中，其品質變化是一個時變過程，因此要實現香蕉腐敗的早期預警，最為關鍵的是準確確定香蕉腐敗的基準。因此，論文首先對復雜的三維熒光信息進行特征選擇以減少分析變量個數，選出能夠表征香蕉貯藏過程中貯藏室氣體變化的特征波長；然后根據選出的特征波長嘗試確定了香蕉腐敗的基準；最后初步探索了香蕉腐敗的早期預警實現方法。目前國內也有研究者運用光譜學對果蔬的腐敗進程進行研究，但是對貯藏庫內果蔬的整體質量監控多集中于對樣品進行隨機取樣檢測，缺乏快速有效的檢測方法。本文的研究旨在為香蕉貯藏期間的腐敗情況提供一種快捷檢測方法的同時，探索了香蕉腐敗的早期預警方法。

1 實驗部分

1.1 材料

第一批香蕉，品種為廣東1號，總重量300 kg，于2019年4月8日購于超市。第二批香蕉，品種為威廉斯，總重量300 kg，于2019年5月6日購于超市?？紤]到貯藏條件僅起到加快或延遲香蕉的品質變化過程，因此為了減少試驗時間，兩批香蕉均常溫貯藏。在香蕉貯藏過程中，每天測量記錄貯藏庫的溫濕度，第一批香蕉在貯藏期間溫度波動范圍在20～24 ℃，相對濕度波動范圍在90%～93%；第二批香蕉貯藏期間溫度波動范圍在20～25℃，相對濕度波動范圍在89%～94%。兩批香蕉貯藏過程中每天均采集三維熒光數據以及pH、相對電導率數據。同時，為了保證腐敗基準確定的可靠性，試驗數據不僅僅截止到感官上出現腐敗為止(約為第6個貯藏日)，還應持續到完全腐敗，使試驗數據能夠覆蓋貯藏過程中香蕉品質變化的全部，為此貯藏試驗均持續了8 d。

1.2 儀器與參數

采用上海雷磁生產的PHS-3E型pH計與DDS-307型電導率儀，廣東環凱微生物科技有限公司生產的HKM-Ⅱ型空氣浮游微生物采樣器，上海盧湘儀離心儀器有限公司生產的TG16A臺式高速離心機，以及江蘇強盛功能化學股份有限公司生產的分析純氯化鈉。

采用美國安捷倫Cary eclipse熒光光譜儀采集3維熒光光譜。激發波長λex范圍設置為200～300 nm，步長為5 nm，共包含21個激發波長，狹縫寬度為5 nm；發射波長λem范圍設置為260～800 nm，步長為2 nm，共包含271個發射波長，狹縫寬度為5 nm，掃描速度為fast，電壓為900 V，激發光源為氙燈，在2 mm×2 mm的石英熒光比色皿中測量。

1.3 理化數據采集

香蕉貯藏過程中能表征其腐敗的指標很多，鑒于pH值測量操作簡便，相對電導率又可以表征香蕉貯藏過程中細胞受損傷程度。因此，選取pH值以及相對電導率值作為理化表征指標。pH值測定：試驗當天從貯藏庫隨機選取3根香蕉，做3個平行樣本。將每根香蕉剝皮，取中間段果肉10 g，放入勻漿機，加入蒸餾水90 mL，每次勻漿時間60 s，然后用4層紗布過濾以去除浮沫及濾渣。用pH計依次測量每個樣本的pH值。每個樣本測3次，以消除儀器誤差，以這3個香蕉樣本的pH平均值作為該貯藏日香蕉樣品的pH值。

相對電導率測定：試驗當天從貯藏庫隨機選取3根香蕉，做3個平行樣本。每根香蕉取約2.5 cm×2 cm的香蕉皮10片，放于錐形瓶中，加入蒸餾水100 mL，用保鮮膜封口，置于常溫搖床中震蕩30 min后取出，依次測量煮前電導率α1。將測量好的樣本重新蓋上薄膜密封，用電爐煮沸10 min，冷卻至室溫，測得煮后電導率α2。相對電導率α用式(1)計算。兩批香蕉樣品pH和相對電導率數據結果如表1和表2所示。

表1 第一批香蕉pH值和相對電導率Table 1 pH value and relative conductivity of the first batch of banana

表2 第二批香蕉pH值和相對電導率Table 2 pH value and relative conductivity of the second batch of banana

(1)

1.4 三維熒光數據采集

用超純水配置0.9%的生理鹽水，pH值為6.66。將5 mL 0.9%的生理鹽水均勻覆蓋在玻璃培養皿中。將采樣器放置于貯藏庫中央位置，放入培養皿，啟動采樣器。采樣量為1 000 L，采樣時間10 min。采樣結束后，將樣品收集到離心管中，并用生理鹽水定容至4 mL?？紤]到從空氣中采集到的水溶性物質為微量級，對樣品進行離心濃縮處理。離心機采用10 000 r·min-1轉速離心1 min，棄去上清液2 mL。將剩余2 mL樣品混勻,進行三維熒光檢測。熒光儀每次使用前預熱30 min。

1.5 熒光數據預處理

將采集到的三維熒光數據經過預處理及特征波長的選擇之后，利用系統聚類分析法(systematic cluster analysis,SCA)及主成分分析(principal component analysis,PCA)進行香蕉的腐敗預警。本文采用的主要方法及流程如圖1所示。

圖1 處理方法流程圖Fig.1 Processing method flowchart

1.5.1 基線漂移去除

由于樣品在進行三維熒光檢測時其數值會出現漂移現象，也就是相對于坐標軸軸線熒光數據整體會出現上浮(正值)或者下移(負值)。由于儀器本身設置的最大熒光強度量程為1 000 a.u.，且由于瑞利散射的強度較大，容易出現滿量程現象(兩批香蕉試驗所有檢測樣本的瑞利散射熒光強度均達到滿量程)，則可根據瑞利散射的變化情況及滿量程來確定漂移校正值。具體為：計算某檢測樣本熒光強度最大值(瑞利散射值)與1 000的差值(分正差值和負差值)，然后將該樣本的熒光數據全部加上該差值，使瑞利散射的熒光強度達到1 000，從而達到去漂移的效果。例如某個檢測樣本的瑞利散射熒光強度值范圍為-10～990，便對該樣本的整體熒光數據值加上10，以達到去漂移的效果。

1.5.2 散射去除及平滑處理

熒光漂移校正完成后，用Matlab 2014a中eemscat工具箱對瑞利散射及拉曼散射進行去除處理[8]。為減少環境及儀器噪聲對數據的影響，對每個激發波長下的發射光譜再進行SG卷積平滑處理。

1.5.3 熒光波長初選

由于三維熒光光譜數據量較大且存在冗余信息，因此需要對原始光譜數據進行特征波長的選擇，提取出最能夠表達香蕉貯藏期間品質變化的特征波長，以減少分析變量個數和冗余信息。根據三維熒光數據連續性的特點[9]，使用三階高斯混合分布對每個激發波長下的發射光譜曲線擬合。擬合效果越差，表明該波長下的數據離散性、波動性較大，因此其不能代表被檢測樣本，或者說與被檢測樣本不匹配。

1.6 特征選取方法

1.6.1 特征激發波長選擇

在多元統計分析中，Wilks Λ統計量[10]可以對不同樣本中各變量的區分能力進行評估。Λ值越大，表示變量間相似性越大；Λ值越小表示變量間越有差異。由于Wilks Λ統計量要求輸入變量之間無相關性，因此對原始數據不同激發波長的主成分得分進行Λ值計算。再根據從小到大排序的Λ值來挑選出最合適的特征激發波長。Wilks Λ值的計算表達式如式(2)所示。

(2)

式(2)中，T為三維熒光數據矩陣分析過程中主成分得分矩陣的總離差，D為矩陣中每列數據的組內離差。將檢測樣本在不同激發波長下的發射光譜數據劃分為一組。Λ值越小，說明對應的激發波長越能反應香蕉貯藏期間品質的變化。

實際上，在特征激發波長的選擇過程中可分為初選和再選兩步，由上述方法初選激發波長后按下面1.6.2給出的方法選擇特征發射波長，然后根據選出的發射波長再用Wilks Λ統計量反選出更少更具有代表性的特征激發波長。

1.6.2 特征發射波段選擇

考慮到熒光光譜數據的整體性，特征波段更能體現樣本信息，因此根據選出的特征激發波長的全發射光譜，使用間隔偏最小二乘法(interval partial least squares,iPLS)對其進行特征發射波段的選擇。該方法通過將全發射光譜分為若干等間隔的子區間，在每個子區間上運用PLS分析，在不同子區間由交叉驗證得到的交叉驗證均方根誤差(root mean square error of cross validation,RMSECV)來衡量區間回歸模型的精度。

1.7 基準確定及預警方法

1.7.1 腐敗基準界定

香蕉在貯藏過程中，隨著貯藏過程的進行，相鄰兩天或幾天的相關距離越小，相關性越強，說明這兩天的香蕉品質越相似；相鄰兩天的相關距離越大，相關性越差，說明這兩天香蕉的品質變化大，因此根據不同貯藏時間的香蕉品質相似性來實現香蕉腐敗基準的確定。為了確定腐敗基準，先將每天試驗樣本自成一類，然后根據基于歐氏距離的系統聚類[11]將最接近的兩類并成一個新類；通過計算新類與其他各類間的相似性，再選擇最接近的兩類合成新類，直到所有的樣本都并成一類。最后，根據聚類結果可判別腐敗基準。

1.7.2 早期預警初探

在臨床中,婦科腹腔鏡手術是比較常見的手術方式,而以往婦科腹腔鏡手術主要是采用全身麻醉。給予患者施行全身麻醉后,患者會出現各種不良反應,及應激反應,影響手術治療效果,影響術后疾病康復[1]。因此,尋找何種麻醉條件以及麻醉方法可以更優越,是目前臨床重要待解決問題。本次研究工作旨在探討觀察全麻復合硬膜外麻醉用于婦科腹腔鏡手術中的臨床效果?，F作以下報道。

主成分分析(PCA)[12]是一種信息融合方法，也是一種數據分析空間的變換方法。對選出的特征波長進行PCA處理，初步探索了利用PCA的第1主成分的變化來度量香蕉貯藏期間可能出現的腐敗接近度，以此實現早期預警。

2 結果與討論

2.1 三維熒光光譜預處理

2.1.1 散射去除及平滑結果

為去除瑞利及拉曼散射，減少噪聲影響，對三維熒光光譜進行去瑞利及SG平滑處理，圖2給出了熒光數據預處理前后情況。由兩圖對比發現，圖2(b)已經有效的消除了三維熒光光譜數據中瑞利散射及拉曼散射的不利影響，同時圖2(b)比圖2(a)的熒光光譜等高線圖區域邊際線平滑，說明已經減少了噪聲等環境因素的影響，有利于后續數據的分析。

圖2 散射去除及平滑處理前后熒光光譜圖(a)：處理前；(b)：處理后Fig.2 Fluorescence spectrum before and after scatter removal and SG smoothing(a)：Before processing；(b)：After processing

2.1.2 熒光光譜初選結果

在進行數據分析時發現，樣品在發射波長600～800 nm的波段基本不產生熒光，其熒光強度接近于0，因此去除后100個發射波長(Em:600～800 nm)。同時對檢測樣本21個激發波長下的發射光譜進行三階高斯混合分布擬合，結果如表3、圖3所示。

表3 三階高斯擬合結果Table 3 Third-order Gaussian fitting result

圖3 初步篩選前后的熒光激發波長下的發射光譜(a)：初選前；(b)：初選后Fig.3 Emission spectrum at the fluorescence excitation wavelengths before and after preliminary filtering(a)：Before preliminary filtering；(b)：After preliminary filtering

由表3可以看出前5個激發波長的擬合效果不夠理想，表明其離散性較大，數據不夠穩定，或許是這些激發波長本身不匹配要檢測的對象，因此去除前5個激發波長。經過預處理后的熒光數據去除了雜亂信息的干擾和與檢測樣本不匹配的數據。圖3給出了預處理前后的熒光數據不同激發波長下的發射光譜圖。

2.2 特征選擇

對兩批香蕉預處理后試驗數據采取Wilks Λ值進行特征激發波長選取，Λ值排序后對應的激發波長如表4。由表4可以看出，綜合兩批次香蕉試驗，初步選取5個Λ值較小且共有的特征激發波長為225，230，235，240和 255 nm。

表4 兩批香蕉試驗Λ值排序后的激發波長(Ex)Table 4 Excitation wavelengths sorted by Λ values of two batches of banana

2.2.2 特征發射波段選取結果

將初選出的特征激發波長看作不同的變量，結合每批次試驗各自的pH值、相對電導率值，利用iPLS進行特征發射波段的選取。發射光譜在260～600 nm間共包括171個波長點，發射波長變量編號為1—171，采用試湊法，將發射光譜劃分為13個等間距的子區間，交互值為12。圖4給出了兩批香蕉試驗發射光譜特征波段選取情況。橫坐標代表發射波長變量編號，縱坐標代表不同子區間的交互驗證均方根誤差值(RMSECV)。

由圖4(a)可以看出第一批香蕉試驗的第2，3，4，5和6個子區間的RMSECV值較低，模型精度較高，說明這幾個子區間能夠體現不同貯藏日期香蕉的品質變化。由圖4(b)可以看出第二批香蕉試驗的第3個子區間的RMSECV值較低?？紤]到選出的特征波長要能夠表征品種不同、貯藏日期不同的香蕉品質變化，因此選取兩批香蕉試驗共有的特征發射波段作為特征區間，即第3個子區間：316～342 nm，包含14個發射波長。因此共選出5個激發波長下各14個發射波長，共70個特征波長。

圖4 兩批香蕉發射光譜特征發射波段(a)：第一批香蕉；(b)：第二批香蕉Fig.4 Emission spectrum feature bands of the two batches of banana(a)：The first batch；(b)：The second batch

為進一步減少分析變量個數，根據篩選出的14個特征發射波長，使用Wilks Λ統計量對熒光數據預處理篩選出的16個激發波長再選，結果如表5所示。由表5可以看出，最后共選出了3個Λ值較小的特征激發波長：225，230和235 nm。因此對應此3個特征激發波長下各選14個特征發射波長，共42個特征波長。

表5 兩批香蕉試驗Wilks再選Λ值排序后的激發波長(Ex)Table 5 Excitation wavelengths sorted by Λ values of reselected Wilks of two batches of banana

2.3 確定腐敗基準及預警

2.3.1 腐敗基準確定

對選出的42個特征波長的光譜數據進行系統聚類分析，根據類與類之間的相似性來對兩批香蕉進行貯藏期間的腐敗基準確定。圖5給出了兩批香蕉試驗聚類分析的結果。

由圖5可以看出，兩批香蕉雖然品種不同，但系統聚類分析可以實現對其貯藏進程中的品質分類，從而確定腐敗基準。由圖5(a)可以看出，根據選出的特征波長信息，第一批香蕉在貯藏的第1，2，3，4天信息相似性高，因此將其歸為一類，說明前4天香蕉的品質相近，而第5天沒有與前4天歸成一類，說明香蕉在第5天品質發生變化。因此第一批貯藏試驗選用第5天的貯藏庫氣體熒光信息來表征香蕉腐敗基準信息。由圖5(b)可以看出，由于香蕉品種的不同，第二批貯藏試驗的類間距離與第一批有差異，但使用系統聚類分析還是可以實現對貯藏期間香蕉的品質分類，從而確定香蕉的腐敗基準信息。同理，選用第5天的貯藏庫氣體熒光信息作為第二批貯藏試驗的香蕉腐敗基準信息。

圖5 兩批香蕉聚類分析結果(a)：第一批香蕉；(b)：第二批香蕉Fig.5 Cluster analysis results of the two batches of banana(a)：The first batch；(b)：The second batch

2.3.2 預警實現

對選出的特征波長的光譜數據進行PCA處理，結果如圖6所示。

圖6 兩批香蕉PCA結果(a)：第一批香蕉；(b)：第二批香蕉Fig.6 PCA results of the two batches of banana(a)：The first batch；(b)：The second batch

由圖6給出了兩批香蕉特征波長PCA處理的第1主成分與第2主成分結果，通過兩批次貯藏試驗數據對比可以看出兩批香蕉雖然品種不同，但是存在相同的腐敗閾值。由圖6(a)和(b)可以看出腐敗前4天與腐敗后2天可以從第1主成分明顯分開，因此可以初步確定第1主成分的值在0作為香蕉腐敗的閾值，達到該值即意味著香蕉出現腐敗。由此可以推斷即便是不同品種、不同成熟度的香蕉在貯藏進程中都會達到該腐敗閾值，從而確定貯藏庫內香蕉的腐敗情況，實現對香蕉的腐敗預警。

3 結 論

通過使用熒光儀采集兩批貯藏日期不同、品種不同的香蕉在貯藏期間貯藏室空氣的3D熒光信息，在對原始熒光數據進行去漂移，散射去除及SG平滑處理后，實現了熒光數據的初步篩選。然后，根據Wilks Λ統計量對激發波長進行初選和反選，并結合iPLS對熒光數據進行了特征發射波段選取，最終選出3個不同的特征激發波長以及它們分別對應的14個特征發射波長。在此基礎上，利用聚類分析確定了兩批香蕉的腐敗基準，并初步探索了PCA用于香蕉腐敗的早期預警方法。結果表明，在運用給出的特征波長選擇方法所選出的特征激發波長和特征發射波長的基礎上，利用系統聚類分析法能夠實現香蕉貯藏過程中腐敗基準的確定，并通過PCA分析基本實現了香蕉貯藏過程中產生腐敗的早期預警。因此，研究提出的激發特征波長和發射特征波長的選擇方法是有效的，所給出的早期預警方法也是可行的。另外，以貯藏庫中氣體的均勻一致性取樣取代香蕉個體的隨機性取樣，可克服香蕉樣本自身之間差異的影響，使研究結果更加可靠、準確。因此，該研究方法及結果具有普遍的指導價值。