近紅外高光譜成像技術在篩查保健食品中違禁添加抗炎藥物雙氯芬酸鈉的研究

王 成，于 航，姚衛蓉，成玉梁，郭亞輝，錢 和，譚志強，謝云飛*

1.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122 2.中國科學院生態環境研究中心環境化學與生態毒理學國家重點實驗室，北京 100085

引 言

雙氯芬酸鈉(Diclofenac sodium)是一種非甾體抗炎藥，常被用于疼痛、風濕性關節炎和某些非風濕性疾病，其對哺乳動物有多重負面影響，包括心毒性、肝毒性、腎毒性、神經毒性、基因毒性和血液毒性[1]。

目前，非甾體抗炎藥在獸藥中被廣泛使用?？梢杂靡合嗌V-串聯質譜法(LC-MS/MS)測定牛奶[2]、豬肉和雞蛋中的雙氯芬酸鈉[3]。從廢水、尿液、牛乳和血漿中使用電膜萃取作為酸性化合物的雙氯芬酸鈉，并采用高效液相色譜法進行定量分析[4]。同時，雙氯芬酸鈉在水體中降解性差，在污水處理中不易被處理，對水生生物如魚類、貽貝等具有潛在毒性[5]。以AgMBA@SiO2-Ab為免疫探針，采用基于表面增強拉曼散射(SERS)的免疫層析法可以快速、定量、超敏檢測水樣中的雙氯芬酸[6]。這些實驗方法都要做較多前處理實，比較耗時。近紅外光譜結合人工神經網絡無損定量分析雙氯芬酸鈉粉體[7]的方法在一次檢測中也需要大量的實驗樣品。

雖然近紅外是一種有效的無損檢測手段，但是不能提供被測物質的空間信息及化學信息的變化。相較之下，近紅外高光譜成像(near-infrared hyper spectral imaging，NIR-HSI)將計算機成像系統和傳統的近紅外技術結合，可以同時采集待測物的空間信息和化學信息。近紅外高光譜成像技術在食品檢測領域已有研究，在近紅外區間(990～1 700 nm)建立并評價自特征提取的深度學習模型用于無損檢測摻假紅肉產品[8]或鑒別轉基因大豆。利用NIR-HIS在990～1 700 nm結合光譜相似性測量方法[9]、偏最小二乘法[10]、波段比[11]方法分析了奶粉中非法添加三聚氰胺。NIR-HSI用于研究了無損定量檢測花生籽粒中的油和蛋白質含量以及鴨梨中檢測可溶性固形物含量[12]。嘗試近紅外高光譜成像技術與紫外分光光度法結合來估計大麥麥芽中酚類化合物的濃度[13]。

本文主要是探索利用近紅外高光譜成像(1 000～2 500 nm)無損、快速檢測緩解炎癥保健食品中違禁添加的化學物質的方法，闡述近紅外高光譜成像技術在快速定量檢測保健食品中違禁添加抗炎藥物雙氯芬酸鈉的可能性。

1 實驗部分

1.1 樣品

實驗用緩解炎癥保健食品從Perth WA Australia代購，沒有任何化學預處理。雙氯芬酸鈉標準品(99%從上海Macklin)購買。保健食品和雙氯芬酸鈉混合物作為訓練集的樣本濃度(W/W)分別為0.01%，0.02%，0.04%，0.06%，0.08%，0.10%，0.20%，0.40%，0.80%，1.00%，2.00%，4.00%，6.00%，8.00%，10.00%，12.00%，14.00%，16.00%，18.00%和20.00%，每個濃度樣品各3組(編號1—20)，共60個樣本。測試集的混合物濃度(W/W)為0.05%，0.50%，1.50%，5.00%，11.00%，15.00%每個樣品濃度各3組(編號CK1—6)，共18個樣本。保健食品粉碎后，樣品濃度(W/W)低于0.02%的混合物稱取10 g，其他濃度樣品混合物各稱取6.7 g，稱好放入50 mL離心管中在振蕩器上混合均勻。將混合樣品取出裝滿塑料培養皿(直徑30 mm×厚度10 mm)中，輕輕振蕩使得樣品表面平整。同一樣品重復兩次測量光譜數據。

1.2 高光譜成像系統

采用GaiaSorter-N25E室內近紅外高光譜成像系統(四川雙利合譜科技有限公司)，高光譜設備主要由四個部分組成，包括短波紅外高光譜相機、光源、樣品置物臺和計算機。其中光源是由2套50W鹵素燈光源組成，兩組光源被安置在平臺兩側，光源高度為25 cm，安裝角度為30°。短波紅外高光譜相機包括芬蘭Specim公司的Imspector系列成像光譜儀和MCT探測器，波段范圍為982～2 591 nm，光譜分辨率為12 nm(288個波長)。高光譜相機的曝光時間設置為8 ms，樣品放置在電機移動平臺上，移動范圍9～27 cm，在成像系統視場范圍內對樣品逐行掃描，步進電機由相連的計算機控制，掃描前進的電機速率為0.8 cm·s-1。利用光譜圖像軟件實現了系統控制和數據采集。

此外，為了獲得較穩定和有可比性的模型數據，還需要使用兩個額外的圖像:一個暗電流圖像(D)和一個白色參考圖像(W)來校正原始獲得的圖像(R0)[14]。反射率大約為0%的暗電流圖像(D)是通過用不透明的遮光罩完全覆蓋攝像機鏡頭獲得的，而漫反射系數為～99.9%的白色參考圖像(W)，校正公示為

(1)

所有的暗板，白板都由系統自帶，通過高光譜軟件獲得校正光譜數據。

1.3 高光譜數據分析

對采集的高光譜圖像由ENVI4.8軟件(ITT Visual Information Solutions,Boulder,CO,USA)提取和計算感興趣區域的平均光譜數據，選擇1 000～2 524 nm波段及特征波段的光譜作為定量分析的輸入變量。

光譜數據包含的信息比較豐富，大量的信息會包含各種各樣的隨機噪聲，相機暗電流等，會對數據分析產生較大影響[15]。在建立模型前對光譜數據進行預處理是有必要的，可以減少噪聲及外界的影響。主要的預處理方式有移動平均法(moving average，MA)，高斯濾波(Gaussian filter，GF)，中值濾波(median filter，MF)，歸一化(normalize)，卷積平滑(savitzky-golay smoothing，SG-Smoothing),標準正態變量(standard normal variate，SNV)，基線處理(baseline)，多元散射校正(multiplicative scatter correction，MSC)。數據的預處理和分析都使用The Unscrambler X10.4(CAMO Software AS,Norway)。

使用三種線性回歸的模型，包括偏最小二乘回歸(partial least squares regression，PLSR)，主成分回歸分析(principal component regression，PCR)及多元線性回歸(multiple linear regression，MLR)模型。

(1) PLSR模型

建立PLSR模型，將樣本的光譜與違禁添加物的濃度聯系起來。當被測變量眾多且高度共線(相關)時，PLSR成為構建模型的最穩健、最可靠的化學計量方法。通過PLSR找出自變量(X)與因變量(C)之間的基本關系，從而將原來的預測因子簡化為主成分因子(LVs)的新變量集，該變量矩陣具有最佳的預測能力[16]。這些LVs在統計上是獨立的，即不相關，為了防止模型出現過擬合或欠擬合，要選擇最優的Lvs的數量[17]，在本文使用內部交叉驗證(cross-validation，CV)過程中使用均方根(root-mean-square,RMS)的最小值來選擇LVs的最優數量。PLSR中自變量(X)與因變量(C)的基本關系可以用式(2)來表示

C=B1X1+B2X2+…+BnXn+B0

(2)

式(2)中，C為雙氯芬酸鈉的濃度，B1—Bn是272個波長對應的回歸系數，X1—Xn為每個濃度樣本的光譜，B0是回歸系數的截距。

(2) PCR模型

PCR分成兩步，首先對光譜矩陣進行主成分分析，得到少數原始光譜矩陣的線性組合變量，并將數據的最大方差投影到新的坐標，選取出重要的主成分數，進行多元線性回歸。

(3) MLR模型

多元線性回歸模型用于確定多個自變量的組合來共同估計因變量，本研究需要選擇好特征光譜波長或區間建立模型預測保健食品中混合的雙氯芬酸鈉的含量，MLR的公式如式(2)。

1.4 選擇特征波段

高光譜圖像中的信息量豐富，存在高維的、多共線性的預測準確性降低的問題。因此，找出特征波段，利用有效的特征波段信息與雙氯芬酸鈉的含量建立關系，提高模型準確性很有必要。采用基于PLSR模型加權回歸系數從全光譜范圍中選擇特征波長[12]。加權回歸系數的方法,也稱為β系數方法，用產生的絕對值大的回歸系數作為最佳波段并建立MLR模型。

1.5 模型評價

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(4)

(5)

式中，n是樣品數，Ycal是樣品的訓練值，Ypi是樣品的預測值，Yti是樣品參考真實值，Ym是樣品參考的平均值。

2 結果與討論

2.1 雙氯芬酸鈉的近紅外高光譜分析

提取雙氯芬酸鈉(Diclofenac)、緩解炎癥保健食品(KB)、緩解炎癥保健食品中不同含量的雙氯芬酸鈉混合物(編號1—20)的平均原始譜圖(提取面積為直徑30 mm培養皿樣品表面的ROI)，如圖1所示。從圖1可以看出雙氯芬酸鈉的吸收峰與緩解炎癥保健食品的吸收峰位置有明顯區別，即平均光譜圖中雙氯芬酸鈉的吸收峰在1 141，1 507和1 675 nm為XH(C，N，O)第一泛音、伸縮振動及XH(C，N，O)合頻，2 161和2 407 nm為組合頻吸收[18]。緩解炎癥保健食品與緩解炎癥保健食品中摻有不同含量的雙氯芬酸鈉混合物的平均原始光譜無法區分。

圖1 雙氯芬酸鈉(Diclofenac)、緩解炎癥保健食品(KB)、緩解炎癥保健食品中不同含量的雙氯芬酸鈉混合物(編號1—20)的平均原始譜圖Fig.1 Mean original spectra of Diclofenac Sodium，Anti-inflammatory dietary supplements (KB),different concentrations of diclofenac sodium compounds (No.1—20) in inflammation-reducing dietary supplements

圖2中是三組雙氯芬酸鈉(Diclofenac)、緩解炎癥保健食品(KB)及緩解炎癥保健食品中摻有不同含量的雙氯芬酸鈉混合物(編號1—20)的平行樣品在雙氯芬酸鈉的特征波長1 675 nm處的成像圖。雙氯芬酸鈉和緩解炎癥保健食品的圖像有一定程度的差異，但兩者混合物的成像圖無法肉眼識別其中雙氯芬酸鈉的含量，需要進一步的方法進行區分。

圖2 1 675 nm處緩解炎癥保健食品(KB)、雙氯芬酸鈉(Diclofenac sodium)及緩解炎癥保健食品中0.01%～20%含量的雙氯芬酸鈉高光譜成像圖Fig.2 Hyperspectral images of 0.01%～20% Diclofenac sodium in anti-inflammatory dietary supplements (KB), anti-inflammatory dietary supplements and Diclofenac sodium (Diclofenac) at 1 675 nm

2.2 不同建模方法的比較分析

編號1—20的120個樣品中隨機選擇104個樣品光譜作為訓練集并使用內部交叉驗證，編號CK的36個樣品中隨機選擇30個樣品光譜作為測試集。為了比較不同建模方法對實驗結果的影響，主要使用上述8種處理光譜數據并建立了PLSR，PCR和MLR三種模型，獲得了校正集、驗證集、測試集模型的R2，RMSE等相關參數。

2.2.1 PLSR模型

表1 基于全光譜波長的PLSR模型Table 1 PLSR model based on full spectral wavelength

2.2.2 PCR模型

表2 基于全波長的PCR模型Table 2 PCR model based on full spectral wavelength

2.2.3 MLR模型

表3 基于最佳波段建立MLR模型Table 3 MLR model based on optimal spectral band

圖3 偏最小二乘回歸(PLSR)模型中β回歸系數權值占比選擇較優波段Fig.3 Selection of the optimal spectral bands by weight ratio of β regression coefficients in the partial least squares regression (PLSR) model

2.3 預測結果的驗證

表4顯示了PLSR，MLR和PCR三種模型平均預測值與真實值，其中MLR模型預測的雙氯芬酸鈉含量較低(0.05%)時，平均預測值比真實值偏高，但兩者相差較小，雙氯芬酸鈉含量較高時預測結果更接近真實值。PLSR，PCR模型預測雙氯芬酸鈉含量低于0.5%時的預測值與真實值相差較大。在高濃度時，后兩個模型預測能力相對MLR模型稍差。所以，MLR模型預測不同濃度的雙氯芬酸鈉的準確性和重復性較好，預測能力較強。

表4 PLSR，PCR，MLR模型預測值與真實值比較Table 4 The predictive values of PLSR,PCR and MLR models compared with real value

3 結 論

探討了近紅外高光譜成像技術在緩解炎癥保健食品中添加不同含量抗炎類藥物雙氯芬酸鈉的無損檢測分析。使用了8種不同的光譜預處理方法，建立了全光譜PLSR和PCR模型，利用β系數方法選擇最優波段1 130～1 147，1 412～1 468，1 658～1 709，2 010～2 055，2 122～2 178和2 395～2 423 nm，經SNV預處理方法建立的MLR模型，預測最低限為0.05%，預測值與實測值的R2為0.992 5，RMSECP為0.004 9，SEP為0.004 9。綜上所述，說明近紅外高光譜成像技術可用于快速、定量檢測分析緩解炎癥保健食品中違禁添加的雙氯芬酸鈉，有巨大應用潛力。