UHPLC法同時測定并比較不同廠家、不同劑型益心舒制劑中7種成分含量

雷曉晴，王亞丹，喬三洋，吳宏偉，楊洪軍，李 耿

1.首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院 臨床合理用藥生物特征譜學評價北京市重點實驗室，北京 100038

2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

3.北京中醫藥大學中藥學院，北京 100029

4.中國中醫科學院 中藥研究所，北京 100700

5.中日友好醫院，北京 100029

益心舒制劑為臨床治療冠心病心絞痛的常用中成藥，系國家醫保目錄、國家基本藥物目錄收錄品種。其組方由人參、麥冬、五味子、黃芪、丹參、川芎和山楂組成，系由經典名方生脈散為核心，在合用升陷湯重用黃芪之意的基礎上，加用了活血之川芎、丹參和山楂，具有益氣復脈、活血化瘀、養陰生津之功效[1]。目前，市場上的益心舒制劑有4個劑型11 種產品，膠囊、丸、顆粒和片劑分別有1家、1 家、2 家和7 家企業生產。其中益心舒膠囊曾連續多年入圍《中藥大品種科技競爭力報告》[2]。

《中國藥典》2020年版[3]收載了益心舒丸、益心舒片、益心舒膠囊、益心舒顆粒。其中，益心舒膠囊標準僅有人參皂苷Rg1、Re 和丹酚酸B 3 種成分的含量測定，益心舒丸、益心舒片和益心舒顆粒標準中還規定了人參皂苷Rb1的含量限度；鑒別項下均包括黃芪、麥冬、五味子的薄層鑒別，未涉及川芎和山楂。此外，目前對益心舒制劑質量研究的文獻多集中于對人參皂苷的含量測定[4-7]，另外還有楊小孟[8]采用高效液相色譜法測定了益心舒膠囊中黃芪甲苷的含量，王紹志等[9]采用HPLC 法測定了益心舒膠囊中丹參素、原兒茶醛、阿魏酸、丹酚酸B 的含量；其他益心舒制劑質量研究還涉及丹參酮、五味子甲素、五味子醇甲等成分[10-20]，本課題組此前采用UHPLC-Q/TOF-MS 技術鑒定識別了益心舒膠囊中的276 種化學成分，初步掌握了益心舒膠囊化學成分的種類[21]，但要全面研究益心舒膠囊質量，比較不同廠家、不同劑型益心舒產品的物質基礎差異，仍有待獲取更多的量化化學信息。

全面研究中藥質量要素的形成和傳遞過程，構建過程化質量控制體系，是突破中藥質量瓶頸的關鍵。獲取足夠多的量化信息，是研究中藥質量要素形成的前提，對于中藥質量研究意義重大。通過建立中成藥產品的檢測方法，可為今后基于藥典標準建立優質中成藥產品質量標準奠定基礎；有利于研究從藥材、飲片到提取物、中間體，再到中成藥的關鍵質量屬性傳遞過程；有利于全面了解不同劑型產品的物質基礎及質量水平；也有利于中藥質量大數據的積累，為實現智能化生產奠定基礎。為了更全面的評價和控制益心舒制劑質量，本研究在藥典檢測方法的基礎之上，進一步拓展定量檢測范圍，建立可以同時檢測益心舒制劑中阿魏酸、迷迭香酸、紫草酸、洋川芎內酯I、丹酚酸B、隱丹參酮和丹參酮IIA7 種化學成分含量的UHPLC 方法，為全面提升益心舒制劑的質量控制水平提供支持，也為全面比較不同益心舒制劑的質量控制水準奠定基礎。

1 儀器與材料

超高效液相色譜（UPLC）Accuracy 系統，包括二元超高壓溶劑系統、自動進樣恒溫樣本管理器、二極管陣列檢測器、Empower 3 色譜工作站，美國Waters 公司；NANO-pure Diamond Ro＋純水系統，美國Thermo Fisher Scientific 公司；KQ5200DE 型超聲波儀，江蘇昆山市超聲儀器有限公司；Sartorius CP225D 電子天平，德國Sartorius 集團。

提取用甲醇，批號20160401，分析純，北京益利精細化學品有限公司；乙腈，色譜純，美國Fisher公司；水為超純水。

對照品迷迭香酸（批號111871-201001，質量分數98.8%）、丹酚酸B（批號111562-201212，質量分數95.4%）、隱丹參酮（批號110852-200806，質量分數98.7%）、阿魏酸（批號110773-200611，質量分數≥99.0%）、丹參酮IIA（批號110766-200619，質量分數≥99.0%），購自中國食品藥品檢定研究院；對照品紫草酸（批號20216-201107）和洋川芎內酯I（批號20157-201703）購自南昌貝塔生物科技有限公司，HPLC 測定質量分數均大于98%。9 批益心舒膠囊，批號分別為20160812、20160814、20160815、20160901、20160910、20160912、20160913、20160914、20161002，3 批A廠家益心舒片，批號分別為20150301、20150303、20150403，由貴州信邦制藥股份有限公司提供；B廠家益心舒片（頸復康藥業集團有限公司，批號為730042）、益心舒顆粒（山東中泰藥業有限公司，批號為17030215）、益心舒丸（昆明賽諾制藥股份有限公司，批號為16091402）均為市售。不同益心舒制劑的規格及用法用量見表1。

表1 不同益心舒制劑的規格及用法用量Table 1 Specifications,usage and dosage of different Yixinshu preparations

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 取10 粒益心舒膠囊內容物，置于稱量紙上，混合均勻，精密稱取約0.5 g，（其他益心舒制劑以含有相等的藥材投料量等比例折算，折算方法見表2），置于150 mL 具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL（不同制劑根據稱樣量按比例折算，見表2），稱定質量，超聲處理30 min，放置冷卻至室溫，用甲醇補足減失的質量，搖勻，溶液過0.22 μm 微孔濾膜，棄去初濾液，續濾液作為供試品溶液。

表2 不同益心舒制劑的稱樣量及加入甲醇體積計算Table 2 Weighting sample and methanol adding volume calculation of different Yixinshu preparations

取益心舒片10 片，置于研缽中研細，混合均勻，精密稱取約0.5 g，置于150 mL 具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，同法制備供試品溶液。

取益心舒丸1 袋，置于研缽中研碎，精密稱取約0.83 g，置于250 mL 具塞錐形瓶中，精密加入甲醇83 mL，同法制備供試品溶液。

取益心舒顆粒1 袋，精密稱取約1.67 g，置于250 mL 具塞錐形瓶中，精密加入甲醇167 mL，同法制備供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸、迷迭香酸、紫草酸、洋川芎內酯I、丹酚酸B、隱丹參酮和丹參酮IIA對照品適量，分別加甲醇溶解制成含阿魏酸3.74 μg/mL、迷迭香酸110.0 μg/mL、紫草酸123.0 μg/mL、洋川芎內酯I 22.0 μg/mL、丹酚酸B 1.86 mg/mL、隱丹參酮121.0 μg/mL 和丹參酮IIA36.3 μg/mL 的對照品儲備液。分別精密吸取各對照品儲備液1 mL，加甲醇定容至10 mL，即得混合對照品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱為Waters Acquity HSS T3 柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為0.5%甲酸水溶液-乙腈系統，色譜洗脫梯度：0～1 min，3%～4%乙腈；1～4 min，4%～18%乙腈；4～9 min，18%～42%乙腈；9～11 min，42%～63%乙腈；11～14 min，63%～73%乙腈；14～15 min，73%～100%乙腈；體積流量0.4 mL/min；檢測波長：322 nm，阿魏酸；280 nm，迷迭香酸、紫草酸、洋川芎內酯I、丹酚酸B；265 nm，隱丹參酮、丹參酮IIA；進樣量2 μL；柱溫37 ℃；樣品管理器溫度4 ℃?；旌蠈φ掌芳皹悠返纳V圖見圖1。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 依次精密量取混合對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μL，按“2.2”項下色譜條件分別進樣，記錄各成分峰面積，以色譜峰峰面積為縱坐標（y），進樣質量為橫坐標（x）進行線性回歸，結果見表3?？梢钥闯?，7 種成分在各自線性范圍內線性關系良好，所有成分相關系數（r）均在0.999 5 以上。

圖1 3 個不同檢測波長下混合對照品 (322 nm,a; 280 nm,c; 265 nm,e) 和樣品-益心舒膠囊 (批號20160812,322 nm,b; 280 nm,d; 265 nm,f) 的UHPLC 圖Fig.1 UHPLC of mixed reference substances (322 nm,a; 280 nm,c; 265 nm,e) and sample (batch 20160812,322 nm,b; 280 nm,d; 265 nm,f) at three different wavelengths

表3 線性關系考察結果Table 3 Investigation of linear relationship

2.3.2 精密度考察 精密量取混合對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件連續進樣6 次，記錄各成分峰面積，計算6 次峰面積的RSD 值，結果見表4。7個待測成分峰面積的RSD 在0.45%～1.14%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩定性考察 取益心舒膠囊（批號20160812）內容物約0.5 g，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、24 h 按“2.2”項下色譜條件進樣，記錄各成分峰面積，計算6 次峰面積的RSD 值，結果見表4。7 個待測成分峰面積的RSD 在0.35%～1.16%，表明供試品溶液在24 h 內穩定。

2.3.4 重復性考察 取同一批次益心舒膠囊（批號20160812）內容物6 份，每份約0.5 g，按“2.1.1”項下方法分別制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣，記錄各成分峰面積，以外標法計算各成分質量分數及6 份樣品質量分數的RSD 值，結果見表4。7 個待測成分質量分數的RSD 在1.39%～2.46%，表明方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收率考察 精密稱定已測定含量的益心舒膠囊（批號20160812）內容物6 份，每份約0.25 g，分別加入各對照品溶液適量（加入后待測物總量相當于樣品中原有量的100%），按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，并按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄各成分峰面積，以外標法計算含量并計算各成分的加樣回收率及RSD 值，結果見表4。所測7個指標成分的平均加樣回收率在97.56%～104.44%，RSD 值均小于3.72%，表明方法準確度良好。

2.4 樣品測定及結果

分別精密稱取不同益心舒制劑（益心舒片、益心舒丸研碎過篩），按“2.1.1”項下方法制得供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣，記錄各成分峰面積。各對照品儲備液以適當比例稀釋，按“2.2”項下色譜條件進樣，記錄峰面積。以外標法計算各成分含量。

2.4.1 9 批益心舒膠囊含量測定結果 9 批益心舒膠囊中7 種成分的含量測定結果如表5 所示。根據《中國藥典》2020年版規定，益心舒膠囊中每粒含丹參以丹酚酸B 計不得少于1.0 mg，結果顯示，本研究中所測定的所有樣品均符合規定。檢測的7 種成分平均RSD 為13.63%，其中最大為23.19%，最小為9.00%。

表4 精密度、穩定性、重復性和加樣回收率考察結果 (n = 6)Table 4 Investigation of precision,stability,repeatability and average recoveries (n = 6)

表5 9 批益心舒膠囊中7 種成分的含量測定結果Table 5 Content of seven components in nine batches of Yixinshu Capsules

2.4.2 不同廠家益心舒片中7 種成分的含量測定結果 益心舒片為多家產品，由7 家企業生產。不同廠家益心舒片的規格和服用劑量不同，為產品質量一致性比較增加了難度。本研究收集了多家企業的益心舒片樣品，但由于部分企業產品執行的標準中工藝制法未公開，難以確定其生產時的投料量及制成片數，故本研究僅納入2 家規格和用法用量與藥典標準一致的益心舒片，對有關成分含量進行對比分析。結果見表6。根據《中國藥典》2020年版規定，益心舒片每片含丹參以丹酚酸B 計不得少于1.5 mg，結果顯示，本研究中所測定的所有樣品均符合規定。然而本研究所考察的2 廠家生產的益心舒片中丹酚酸B 含量相差約一半，A 廠家3 批產品的平均值為10.859 7 mg/g，而B 廠家的含量達到了20.970 4 mg/g。A 廠家內部3 批次產品之間的RSD相對較小。

本研究比較了不同廠家生產的益心舒片中7 種化學成分的含量差異。為了能夠更直觀的反映差異程度，將各化學成分的質量分數轉化為該成分含量平均值的相對百分當量，如圖2 所示。A 廠家生產的益心舒片中7 種化學成分含量均低于2 廠家平均值，而B 廠家益心舒片高于平均值，其中，丹參所含的化學成分丹酚酸B、隱丹參酮和丹參酮IIA的含量差距較大，川芎所含的阿魏酸和洋川芎內酯I 含量差距相對較小。

表6 不同廠家益心舒片中7 種成分的含量測定結果Table 6 Content of seven components in Yixinshu Tablets produced by different manufacturers

圖2 不同廠家益心舒片中7 種化學成分的含量均值百分當量分布圖Fig.2 Percent equivalent relative to average content distribution of seven chemical components in Yixinshu Tablets produced by different manufacturers

2.4.3 不同益心舒制劑中7 種成分的含量測定結果及比較分析 為全面比較不同益心舒制劑中化學成分的差異，綜合研判益心舒制劑質量，本研究分別從成分含量及相對當量、成分日攝入量及相對當量、成分含量一致性3 個方面對其進行比較分析。不同益心舒制劑中7 種成分的含量測定結果見表7。根據《中國藥典》2020年版規定，益心舒丸、益心舒顆粒中每袋含丹參以丹酚酸B 計不得少于3.0 mg，結果顯示，本研究中所測定的樣品符合規定。

比較不同益心舒制劑中7 種化學成分的質量分數當量（%，相對于益心舒膠囊），如圖3 所示。通過比較可知，益心舒膠囊中藥典規定指標性成分丹酚酸B 高于其他制劑，其他成分均稍低于其他制劑，其中阿魏酸相對更低。阿魏酸、洋川芎內酯I 的含量在益心舒丸中分布較高，此2 種成分均為川芎的特征成分；另外，由于輔料用量相對較大，益心舒顆粒中所含化學成分的含量低于其它劑型。

2.5 結果分析

2.5.1 不同益心舒制劑中7 種成分的日攝入量 經計算，不同益心舒制劑的日服用生藥量是一致的，見表8。因此，本研究將7 種成分的質量分數轉化為日攝入量（表9），以更好的比較不同益心舒制劑之間的差異。

以不同益心舒制劑中7 種化學成分的日攝入量當量（相對于益心舒膠囊）作圖，如圖4 所示。根據不同益心舒制劑日攝入量當量的柱形圖分布可以看出，除洋川芎內酯I 外，益心舒顆粒中其他6 種成分的日攝入量均最高；洋川芎內酯I 的日攝入量在益心舒丸中分布最高。

表7 不同益心舒制劑中7 種成分的含量測定結果Table 7 Content of seven components in different Yixinshu preparations

圖3 不同益心舒制劑中7 種化學成分的質量分數當量分布圖Fig.3 Mass fraction equivalent distribution of seven chemical components in different Yixinshu preparations

表8 不同益心舒制劑的日服用生藥量Table 8 Daily intake dosage of crude medicinal materials of different Yixinshu preparations

表9 不同益心舒制劑中7 種成分的日攝入量Table 9 Daily intake dosage of seven components in different Yixinshu preparations

2.5.2 益心舒制劑產品成分日攝入量離散性 從總體上計算并比較不同批次益心舒膠囊、不同批次益心舒片（A 廠家）、不同益心舒制劑（益心舒片中的成分含量以2 廠家的平均值計）中7 種成分日攝入量的RSD 差異，如圖5 所示?？梢钥闯?，7 種化學成分日攝入量的RSD，9 批益心舒膠囊中大多在10%左右，僅有阿魏酸和洋川芎內酯I 偏高，約為20%。3 批A 廠家益心舒片除隱丹參酮和丹參酮IIA外，其余成分的RSD 均小于20%。不同益心舒制劑之間最小在20%，最大可高達70%。同一廠家不同批次的益心舒膠囊、益心舒片批間差異相對較好，但不同益心舒制劑中化學成分含量差異極為顯著。

圖4 不同益心舒制劑中7 種化學成分的日攝入量當量分布圖Fig.4 Daily intake dosage equivalent distribution of seven chemical components in different Yixinshu preparations

圖5 不同批次益心舒膠囊、不同批次益心舒片 (A 廠家)、以及不同益心舒制劑中7 種化學成分日攝入量的RSD 雷達圖Fig.5 RSD radar map of daily intake dosage of seven chemical components in different batches of Yixinshu Capsules,different batches of Yixinshu Tablets produced by manufacturer A and different Yixinshu preparations

以成分來看，不同批次益心舒膠囊和不同益心舒制劑中來自丹參藥材的成分RSD 相對來說較小，而來自川芎藥材中的阿魏酸和洋川芎內酯I 的RSD較大。A 廠家生產的3 批益心舒片中，酚酸類成分迷迭香酸、紫草酸及丹酚酸B 的RSD 僅不到10%，而同為丹參中所含成分的隱丹參酮和丹參酮IIA的RSD 卻超過了30%，推測可能的原因與生產過程中工藝參數的控制有關。

3 討論

在《中國藥典》2020年版益心舒制劑標準的基礎上，本研究進一步建立了同時檢測益心舒制劑中阿魏酸、迷迭香酸、紫草酸、洋川芎內酯I、丹酚酸B、隱丹參酮和丹參酮IIA7 種成分含量的方法，為進一步提升益心舒制劑的質量控制水平奠定基礎，也為不同批次產品之間、不同廠家之間及不同制劑之間的比較研究提供參考。

3.1 關于檢測技術方法

本研究分別考察了超聲法和回流法對各成分提取的影響，結果顯示，經兩種方法提取后的供試品溶液，各成分色譜峰高無明顯差異，回流法提取的供試品溶液個別色譜峰還要稍低于超聲法，且操作繁瑣、耗時長。因此，本研究采用超聲法進行提取。分別考察以50%、75%、100%甲醇為溶劑對提取的影響，結果表明，以100%甲醇進行提取更能兼顧到樣品中多個色譜峰，50%、75%甲醇提取的樣品峰高差異不大，低于100%甲醇。進一步比較了超聲時間為15、30、45 min 時對結果的影響，發現30 min 基本可以實現將各個成分提取完全，繼續延長時間，色譜峰高將不再發生明顯變化。

采用PDA 檢測器在190～400 nm 對提取后的益心舒膠囊樣品進行紫外全波長掃描，結果顯示，阿魏酸在322 nm 有最大吸收，迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B 在280 nm 有最大吸收，洋川芎內酯I 在277 nm 有最大吸收，隱丹參酮、丹參酮IIA在265 nm有最大吸收。在最大吸收波長處進行檢測，各成分雜質干擾較少，各色譜峰分離較好，定量準確，重復性好。由于277 nm 與280 nm 十分接近，定量上無明顯影響，故使洋川芎內酯I也在280 nm 下進行測定即可。綜合考察后，本實驗最終選擇在322、280、265 nm 波長處分別檢測益心舒制劑樣品中的相關成分。

對甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.5%甲酸水溶液等作為流動相時對各成分分離及色譜峰峰形的影響進行了考察，結果顯示，以乙腈-0.5%甲酸水溶液為流動相時，由于組分中含有較多的有機酸類成分，酸性條件可以起到抑制H+電離的作用，使色譜峰呈現出較好的峰形，且各色譜峰在該條件下均達到較好分離，因此本研究最終選擇以乙腈-0.5%甲酸水溶液作為流動相。

同時，分別考察了Acquity BEH C18、Cortecs C18和Acquity HSS T3 色譜柱對分離的影響，結果顯示，由于本研究所測定的7 種化學成分中含有較多的極性成分，同時還有隱丹參酮和丹參酮IIA2 個低極性成分，以Acquity HSS T3 柱作為色譜柱時，可以更好的增強極性成分的保留，同時減弱疏水性成分的保留，使極性與非極性成分達到較好的平衡，各色譜峰分離效果及峰形均最好。同時，由于HSS T3色譜柱在高水相條件下對較低pH 值的流動相有較好的耐受力，更適用于在本研究所建立的方法條件下使用。

3.2 關于測定結果分析

由于工藝、制法、劑型、規格、服用量等因素影響，不同益心舒制劑的質量難以簡單的橫向比較。本實驗嘗試通過成分含量、日攝入量、離散性多個維度的比較，較為綜合的呈現不同批次、不同廠家、不同劑型益心舒制劑間的成分差異和質量特點。

同一廠家不同批次的產品，原料來源、制法與生產工藝均相對固定，成分含量波動區間相對較小，不同成分含量的差異主要源于原料波動和生產過程控制水平。不同批次的益心舒膠囊之間，成分含量的RSD 大部分在15%以內；同一廠家的3 批益心舒片之間，多數成分含量的RSD 在20%以內。

不同劑型的益心舒制劑，由于制法工藝及輔料添加量存在差異，導致成分間的質量分數差異更為懸殊。相對而言，膠囊劑、片劑輔料應用相對較少，制劑中多種化學成分的含量較高，有利于實現較小的日服用劑量，具有較好的便攜性和順應性；顆粒劑由于輔料占比相對較高，制劑中各類成分含量水平偏低，服用量較大，其優點是服用后吸收較快、作用迅速。

3.3 關于化學成分定量分析

中藥化學成分復雜，藥效作用多樣。含量測定在不同的時間、空間以及使用不同的儀器時具有一定的可重復性，定量檢測數據具有較好的可比性，尤其在信息化、大數據時代，基于含量測定的文獻分析可以量化的比較中藥質量變遷。

對于復方中藥而言，多成分含量測定具有其它方法難以比擬的量化評估產品質量的優勢。一方面，對于企業來說，多成分含量測定不僅可以作為企業的內控標準，用于產品的批間一致性評價研究，而且也可反映一定歷史時期內用于生產的原料藥材的質量變化，有助于進一步固定產地、廠家等，對更好的控制和保證藥品質量具有重要意義；另一方面，多成分含量測定還可以用于不同企業之間藥品質量的橫向對比研究。

本研究借鑒中藥化學全息理念策略[22]，在當前技術條件下，擬盡可能多的實現對益心舒膠囊中化學成分的定量分析，但由于涉及的化學成分復雜，理化性質差異顯著，難以以同一提取方法在同一色譜條件下進行檢測，因此本實驗重點探討了其中有機酚酸類、內酯類、菲醌類成分的檢測，該成藥中所含的皂苷類、木脂素類等其它成分將在此后的研究中繼續探討。

3.4 關于中藥一致性評價

近年來，藥品集中招標采購成為我國醫藥市場競爭的關鍵環節。然而，招標過程中，需要在產品質量和療效一致的前提下，才能通過價格機制形成有效競爭。近年來我國藥監部門推行仿制藥一致性評價，強調仿制藥質量與療效的一致性，取得了令人矚目的成就。對于化學藥品而言，其效應物質基礎清晰，一致性評價過程中，只要通過藥學等效性和生物等效性驗證，實現體外藥學指標、體內生物利用度一致，即在很大程度上可以保證彼此替代使用，滿足現實需求。本研究也反映出，不同廠家中藥產品之間物質基礎差異顯著，在臨床實踐中，中藥所面臨的產品質量和療效不一致所帶來的問題同樣存在。因此，中藥產品的質量一致性問題同樣值得業界關注。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突