VpSBP3基因負向調控轉基因擬南芥鹽脅迫抗性

陳果，曲衍杰，任桓質，于柏，張玉剛，祝軍，侯鴻敏

(1.青島農業大學園藝學院/青島市園藝植物遺傳改良與育種重點實驗室，山東青島 266109；2.萊陽市照旺莊鎮農業技術推廣站，山東煙臺 265200)

葡萄(Vitisvinifera)是我國最重要的經濟果樹之一，具有很高的經濟價值。在自然條件下，植物體無法隨意的移動，其生存環境是相對固定的，因此，高鹽條件成為了干擾植物正常生長發育的主要因素之一[1]?，F如今，土地鹽堿化的不斷加重，嚴重影響葡萄的產量和以葡萄為原料的加工產業的發展。據研究表明，全球鹽堿地總面積已超過9.5億hm2，其中我國的鹽堿地面積總計約為9 900萬hm2[2]。所以，植物體為了維持自身在逆境條件下的正常生長與發育，通過建立不同的脅迫響應機制來抵抗各種逆境條件[3]。近年來，已有相關研究表明，當植物體受到不同的逆境脅迫時，轉錄因子可以調控相關基因的表達，在抗逆應答反應中發揮作用[4]。

Squamosa啟動子結合蛋白(Squamosa promoter Binding Protein, SBP)最初是從金魚草(Antirrhinummajus)中分離出來的一類轉錄因子。因為SBP基因都擁有一個SBP保守結構域，所以被認為是轉錄因子[5]。SBP保守結構域是一個高度保守的DNA結合域[6-7]，大約由79個氨基酸殘基組成，包括兩個相互作用且缺一不可的鋅指結構，N端為Cys-Cys-His-Cys，C端為Cys-Cys-Cys-His或Cys-Cys-Cys-Cys[8],并且能與順式作用元件TNCGTACAA結合，其核心序列為GTAC[9]。該基因已陸續從擬南芥[10]、白樺樹[11]、衣藻[12]、苔蘚[13]、番茄[14]、水稻[15]中分離出來。前期大量的研究表明SBP基因在調控植物開花時間[16-19]、葉片發育[20-22]、植物激素信號轉導[23-24]、果實著色和成熟[25-26]等諸多方面起著重要作用。

近年來，也有一些關于該轉錄因子在植物非生物脅迫[27-29]方面的功能逐漸被關注。2014年，Cui等[30]發現，SPL9基因被miR156下調后，參與了擬南芥響應鹽和干旱脅迫的反應；2015年Tan等[31]發現SBP基因在白菜中可以響應各種激素處理及非生物脅迫；類似的，2016年Song等[32]的研究也證明了該基因在菊花中同樣具有響應激素處理及非生物脅迫的功能；2017年Arshad等[33]發現MicroRNA156通過降低SBP基因的表達量改善了轉基因苜蓿干旱、鹽脅迫耐性；2018年Hou等[34]通過擬南芥的異源表達證明了某些葡萄SPL基因的耐鹽功能；2019年Wang等[35]通過整合miRNA-Seq和RNA-Seq數據研究了miR156/SPL模塊在耐鹽性中的作用；2020年Zhang等[27]的研究發現CaSBP12基因的過表達提高了辣椒對鹽脅迫的敏感性。本研究通過農桿菌介導法將葡萄VpSBP3轉錄因子在擬南芥中異源表達，獲得轉基因擬南芥株系，并通過非生物脅迫及生理指標的測定初步明晰VpSBP3轉錄因子在葡萄抗逆性方面的功能。該研究在擴大葡萄栽培面積、增加葡萄產量、提高葡萄品質方面有著一定的意義，為以后SBP家族基因在葡萄抗逆性方面的研究奠定了前期理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試材選用‘白河35-1’(Vitispseudoreticulata‘Baihe-35-1’)葡萄株系, 擬南芥(Arabidopsisthaliana)哥倫比亞CO、克隆載體pGEM-T、pCAMBIA2300質粒為本實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1VpSBP3基因的克隆

本試驗參照原平皓植物RNA快速提取試劑盒說明書，采用液氮研磨法提取‘白河35-1’葉片RNA，用DNaseⅠ處理總RNA，參照TaKaRa反轉錄試劑盒說明書進行cDNA的合成，具體試驗步驟參照沙婷[36]的實驗方法。根據歐洲葡萄SBP基因的同源序列設計特異引物，設計帶有XbaⅠ和KpnⅠ酶切位點的引物，上游引物為F：5′-GGCTCTAGAATGGGCTATAATCTGAAGAC-3′XbaⅠ，下游引物為R：5′-GGTACCCTACTCCCAAGAGAACGAGA-3′KpnⅠ。以‘白河35-1’葉片cDNA為模板擴增獲得VpSBP3目的片段，送TaKaRa公司測序。

1.2.2VpSBP3基因組DNA序列的擴增

本試驗參照林延翔[37]的實驗步驟，利用天根公司的DNA提取試劑盒，通過液氮研磨法提取‘白河35-1’葉片總DNA。然后，參照侯鴻敏[38]的擴增反應體系，以‘白河35-1’葉片總DNA為模板進行PCR擴增。

1.2.3 轉基因擬南芥株系的獲得

利用雙酶切法將VpSBP3基因連接到載體pCAMBIA2300-35，測序后將陽性質粒命名為pCAMBIA2300-35S-VpSBP3。將其和pCAMBIA2300-35S空載體通過農桿菌介導的花絮浸潤法轉化擬南芥，獲得T0代種子。在含40 mg·L-1卡那霉素的MS固體培養基上對T0代種子進行篩選，正常生長的苗子確定為轉化陽性苗。

將對照和轉基因擬南芥種子置于4 ℃冰箱中春化3～4 d后，在超凈工作臺上進行消毒處理，然后用移液槍點播在MS+150 mmol·L-1氯化鈉(NaCl)培養基中，置于光照培養箱中光照培養16 h、黑暗培養8 h。最終選取在培養基中與對照表型有差異的轉基因株系作為試驗材料。

1.2.4 鹽脅迫處理下轉基因株系萌發率及根長測定

將T3代轉基因株系、空載體pCAMBIA2300對照和野生對照的種子置于4 ℃冰箱中春化3～4 d后，在超凈工作臺上進行消毒處理，然后分別用移液槍點播在MS和MS+150 mmol·L-1NaCl的培養基上，置于光照培養箱中光照培養16 h、黑暗培養8 h。每2 d觀察并統計一次對照與轉基因株系的萌發率，直到萌發率趨于穩定。同時把MS和MS+150 mmol·L-1NaCl培養基豎放在培養皿架上，生長15 d后，觀察并記錄根長。該試驗分別進行3次生物學和3次技術重復。

1.2.5 失水率及電解質滲漏測定

用150 mmol·L-1NaCl分別對正常生長的野生型和轉基因擬南芥株系進行脅迫處理。7 d后分別取0.1 g表型一致的對照和轉基因株系葉片進行電導率的測定。 首先將所取樣品分別置入含有50 mL蒸餾水的試管中，靜置3～5 h后，用電導儀測其電導值R1，測定結束后將該樣品繼續放入90 ℃水浴鍋中30 min，冷卻到室溫，測其電導值R2，利用公式R1/R2分別計算其相對電導值[39]。該試驗分別進行3次生物學重復和3次技術重復。

1.2.6 丙二醛含量的測定

用200 mmol·L-1NaCl處理轉基因和對照株系的盆栽苗，一周后取0.2 g葉片，參照 Dhindsa等[40]的實驗方法，利用分光光度計測定丙二醛的含量。該試驗分別進行3次生物學重復和3次技術重復。

2 結果與分析

2.1 VpSBP3基因的克隆及序列分析

以‘白河35-1’葉片DNA和總RNA反轉錄合成的cDNA第一鏈為模板，用VpSBP3的特異引物擴增，分別獲得約1 200 bp 和3 200 bp大小的條帶(圖1)。將VpSBP3基因連接到pGEM-T載體上，轉化大腸桿菌并進行測序，在http://www.ncbi.nlm.nih. gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi上進行cDNA序列分析。分析表明，VpSBP3基因含有一個大小為1 170 bp的開放閱讀框，編碼一個含有390個氨基酸殘基的蛋白質。通過InterProScan蛋白數據庫來鑒定該基因的結構域，結果表明VpSBP3基因含有一段高度保守的雙向核定位序列和一個完整的SBP-domain結構域(PF03110)(圖2)。DNA序列分析發現VpSBP3基因的DNA序列長度為3 200 bp，其中3個外顯子長度分別為408、138、624 bp；2個內含子長度分別為1 884、146 bp，其排列的相對位置見圖2。

2.2 轉基因擬南芥株系的獲得

通過花絮浸潤法，將含有pCAMBIA2300-35S-VpSBP3質粒的農桿菌轉化野生型擬南芥，獲得T0代種子。將消毒后的T0代種子鋪在含40 mg·L-1卡那霉素的MS培養基上進行轉基因陽性苗的篩選。結果表明非轉基因擬南芥植株在選擇培養基上逐漸白化死亡，而轉基因植株可以正常生長(圖3A)。將野生對照WT和不同轉基因株系擬南芥T3代種子用移液槍點播在提前配制并滅菌MS+150 mmol·L-1NaCl培養基上，春化后在光照培養箱中繼續正常培養5 d。結果發現，所有的轉基因株系均對鹽脅迫敏感。最終選取在培養基中與對照表型差異最明顯的轉基因株系VpSBP3-26和VpSBP3-42作為后續研究材料 (圖3B)。

2.3 VpSBP3轉基因擬南芥在鹽脅迫培養基上的萌發情況

將野生對照、空載pCAMBIA2300對照和轉基因株系同時播種在MS、MS+150 mmol·L-1NaCl培養基上，每隔2 d統計一次發芽率并拍照觀察，用prism 8.0軟件進行統計分析作圖。發現在MS培養基上野生對照、空載pCAMBIA2300對照和轉基因株系在2 d時開始萌發，8 d后的萌發率均達到100%(圖4A)。而在MS+150 mmol·L-1NaCl培養基上，只有野生對照和空載pCAMBIA2300對照8 d時萌芽率達到100%，而轉基因株系12 d時萌發率才達到最高值80%， 可以明顯看到MS+150mmol·L-1NaCl培養基上，野生對照和空載pCAMBIA2300對照的萌發率高于轉基因株系(圖4B)。從圖5可以看出，MS培養基上的轉基因株系和兩個對照的生長情況基本一致，長勢良好(圖5A)，而脅迫培養基上的兩個對照要比轉基因株系生長的好(圖5B)。以上結果說明轉基因株系對鹽脅迫環境更加敏感，VpSBP3轉錄因子在響應過程中具有負向調控作用。

2.4 VpSBP3轉基因擬南芥在鹽脅迫培養基上的根長情況

將2個轉基因株系和2個對照分別種植于培養皿中，并豎放在培養皿架上。本研究用prism 8.0軟件進行統計分析作圖。觀察發現，MS培養基上的轉基因株系和對照株系的根長基本一致(圖6A,6C)，150 mmol·L-1NaCl脅迫處理20 d后轉基因株系和對照株系的根部生長均受到了抑制，但是轉基因株系的根長顯著低于對照株系(圖6B,6C)。結果表明，VpSBP3基因降低了轉基因擬南芥的耐鹽性。

2.5 模擬鹽脅迫處理下VpSBP3轉基因擬南芥的失水率及相對電解質滲透率

取150 mmol·L-1NaCl處理和正常培養20 d后的轉基因及野生型擬南芥株系進行電解質滲漏處理，分別計算相對電導率。本研究用prism 8.0軟件進行統計分析作圖。從圖7看出，WT、pCAMBIA2300、VpSBP3-

26、VpSBP3-

42在MS培養基上的相對電解質滲透率分別為27.81%、37.60%、36.05%、39.50%，在MS+150 mmol·L-1NaCl培養基上的相對電解質滲透率分別為34.05%、41.23%、66.41%、86.61%。以上結果表明轉基因株系相對電解質滲透率比野生對照的低，轉基因株系對鹽脅迫更敏感，該基因具有負向調控作用。

2.6 鹽脅迫處理下VpSBP3轉基因擬南芥丙二醛含量的測定

用200 mmol·L-1NaCl處理生長健壯的野生型和轉基因株系的擬南芥，每個營養缽澆50 mL，每隔2 d處理一次，處理7 d后，摘取葉片測其MDA含量。本研究用prism 8.0軟件進行統計分析作圖。從圖8中可以看出，在正常條件下培養的野生型和轉基因株系的MDA含量基本一致，但在150 mmol·L-1NaCl脅迫處理下，2個轉基因株系的MDA含量均顯著高于2個對照株系，表明轉VpSBP3基因的擬南芥抗逆性顯著低于野生型。

3 討論

隨著全球環境條件的不斷惡化，導致土地干旱和土地鹽堿化越來越嚴重，使得環境脅迫成為影響植物生長發育的重要因素之一。為了防止這種脅迫的潛在有害影響，植物進化出復雜的網絡機制來識別外部信號，并通過不同的細胞信號轉導途徑進行傳導，導致植物體內產生一系列的脅迫響應轉錄級聯反應，影響了相關基因表達。而基因的表達受植物體內各種轉錄因子的調控，轉錄因子在植物生命活動中起著關鍵的調節作用，與DNA結合域共價結合，從而達到抑制或增強基因表達的作用，常見的參與植物抗逆調控過程有WRKY[41]、MYB[42]、bZip[43]等轉錄因子。

SBP-box基因是一類新的編碼DNA結合蛋白的轉錄因子，他們只存在于綠色植物中。研究表明，這些基因均含有一個SBP保守結構域，其中含有一個C端的雙向核定位信號和兩個結合DNA的鋅指結構。本研究中，對VpSBP3序列分析，發現該基因符合SBP基因的所有結構特征，屬于SBP家族成員(圖2)。相關研究表明SBP轉錄因子作為miRNA156的靶基因，參與了植物對非生物脅迫響應過程[44]，但不同的SBP基因在非生物脅迫響應中表現出了不同甚至相反的功能。在擬南芥中，過表達AtSPL1和AtSPL12能夠提高其耐熱性[45]；干旱、低溫和鹽脅迫等非生物脅迫可以誘導蘋果MdSBP20基因的表達[46]；短期鹽脅迫處理下，MdSPL13的過量表達可以提高蘋果的耐鹽性[47]。與以上研究結果相悖，也有研究表明SBP基因在植物非生物脅迫響應中具有負向調控功能。在擬南芥中miR156可通過下調靶基因AtSPL9提高轉基因株系抗鹽和抗旱能力[48]；辣椒中CaSBP12基因也可負向調控植株對鹽脅迫的耐受性[27]；本研究將VpSBP3基因在擬南芥中過量表達后發現相較于兩個對照，鹽脅迫處理下轉基因株系的種子萌發率更低、根長更短、相對電導率更高和MDA的含量更高。根據以上試驗結果可以推測VpSBP3基因的過量表達可能增強了植株對鹽脅迫的敏感性。該研究為進一步解析miR156/SBP在植物逆境脅迫中的作用機理提供了一定的理論基礎，對植物的抗逆性研究和應用有一定的指導意義。