SP600125孵育影響鯽骨骼發育基因表達

賀 瑜 陳淑娟 何 勝 伍賢龍 蒲麗宇 彭亮躍 肖亞梅

(湖南師范大學生命科學學院,省部共建淡水魚類發育生物學國家重點實驗室,長沙 410081)

SP600125(C14H8N2O)是一種蒽吡唑化合物,作為c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)的高選擇性小分子抑制劑,其作用機制是通過與ATP相互競爭進而與JNK結合抑制c-Jun的磷酸化,從而有效地抑制JNK的活性,對細胞的增殖、分化和凋亡產生顯著影響[1]。本實驗室以培養的二倍體紅鯽(Carassius auratus,red var)尾鰭細胞為材料,SP600125孵育后四倍體細胞數量顯著增加。在此基礎上,通過進一步優化SP600125處理方式和流式分選體系,成功獲得了基于SP600125誘導的同源四倍體鯽細胞系(SP4N-fin,保藏編號為CGMCCNo.9155),該技術獲國家發明專利(專利號ZL 201410317420.2)。以SP4N-fin細胞為核供體,二倍體鯽未受精卵為受體,通過體細胞核移植技術(the Somatic Cell Nuclear Transfer Technique,SCNT),獲得了SCNT四倍體胚胎和1尾尾部畸形的幼魚[2]。雖未得到成魚,但充分顯示了SP600125誘導的四倍體鯽細胞具有良好的發育潛能,為開辟魚類多倍體育種新途徑做出了有益的探索。

多倍體是含有3套或3套以上完整染色體組的生物體,多倍化現象在自然界,尤其是植物中廣泛存在,多倍化事件產生大量新的遺傳材料,增加了基因組復雜性,推動了物種的形成和進化[3]。多倍體魚類對改善品質、加快生長速度、延長壽命、提高產量、控制過度繁殖、保持物種多樣性和培育新品種等方面都具有重要意義,應用于水產養殖可以帶來巨大的經濟效益[4,5]?；赟P600125在體外可以誘導魚類細胞多倍化,本文繼續探究了用SP600125直接孵育受精卵以獲得多倍體魚的可能性。Valesio等[6]發現用JNK抑制劑SP600125處理發育中的斑馬魚(Danio rerio)會導致一系列劑量依賴性缺陷,如心包水腫、頜骨畸形、脊椎彎曲和發育遲緩等。本文的相關研究顯示,SP600125處理鯽受精卵會引起胚胎倍性發生改變,但同時發現SP600125也顯著影響胚胎發育并導致胚胎高死亡率,孵化出膜的處理組魚苗中出現大量脊椎彎曲和尾缺失等畸形個體。在此基礎上,進一步分析了SP600125孵育對魚類骨骼發育相關基因表達的影響,結果表明,在離體和在體狀態下,SP600125孵育會顯著影響骨形態發生蛋白2(Bone morphogenetic proteins 2,bmp2)、淋巴細胞增強結合因子1(Lymphoid-enhancer-binding factor 1,lef1)、酪氨酸蛋白激酶7(Protein tyrosine kinase 7,ptk7)和骨保護素(Osteoprotegerin,opg)等一些與骨骼發育相關基因的表達。

1 材料與方法

1.1 SP600125孵育鯽受精卵

SP600125(Merck-Millipore,美國)溶解于10%二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)配制成1 mmol/L原溶液,然后用超純水進一步稀釋至理想濃度。采用SP600125直接孵育鯽受精卵(單細胞期)的預實驗中,我們觀察到低濃度(＜10 μmol/L)SP600125對鯽胚胎發育影響較弱,而高濃度(＞1 mmol/L)下則胚胎死亡?；赟P600125處理鯽受精卵時長和濃度的預實驗結果,本實驗選用100 μmol/L SP600125對鯽受精卵浸泡處理20min,而后吸去SP600125溶液,胚胎置于曝氣水中室內靜水孵化。分別設置1% DMSO對照組和曝氣水空白對照組。

1.2 SP600125孵育鯽魚苗

在預實驗中,使用不同濃度SP600125(0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8和2.0 μmol/L)對孵化出膜的紅鯽魚苗進行了測試。發現濃度低于0.6 μmol/L SP600125對魚苗的發育沒有顯著的影響,而高濃度(＞1.8 μmol/L)則會導致魚苗在藥物孵育后的第1天就大量死亡?；陬A實驗,選取1.4 μmol/L SP600125溶液浸泡處理出膜第1天鯽魚苗,間隔6h換液一次,第7天統計存活率和畸形率。分別設置0.014% DMSO對照組和曝氣水空白對照組。

1.3 SP600125孵育鯽尾鰭細胞

二倍體鯽尾鰭細胞系(2N)以及利用SP600125誘導建立的同源四倍體鯽細胞系(SP4N)來源于本實驗室。細胞體外培養體系和方法參見我們之前的報道[2]。以鯽尾鰭細胞系為材料,待細胞生長密度達到80%—90% 融合度時將細胞的培養液更換為含100 μmol/L SP600125的培養液培養48h,0.25%胰酶消化后離心收集細胞。

1.4 流式細胞儀倍性檢測

取孵化出膜第1天的魚苗,用尖頭鑷子挑去卵黃囊(每5尾一組,實驗組共隨機取樣30組);3月齡處理組魚剪取尾鰭。將樣品分別置于加入了預先配好的ACD抗凝劑(0.48 g檸檬酸+1.32 g檸檬酸鈉+1.47 g葡萄糖+100 mLH2O)剪碎制備成細胞懸液,經DAPI染液避光染色約10 min,樣品經過20 μL尼龍過濾器過濾,得到的液體進行上機(流式細胞儀)檢測。

1.5 熒光定量PCR檢測

熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,QPCR)引物(表1)由擎科生物公司合成。將收集的魚苗和細胞材料分別用酚氯仿法提取總RNA,Nanodrop2000測定總RNA樣品的純度和濃度。利用逆轉錄試劑盒(RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit,Fermentas公司),將RNA逆轉錄為cDNA。Q-PCR按照SYBR Premix ExTaq試劑盒(Fermentas公司)說明書進行操作。以β-actin內參,采用2－ΔΔCt計算各基因的mRNA相對表達量。

表1 PCR引物序列Tab.1 Sequences of PCR primer

2 結果

2.1 SP600125孵育受精卵對鯽發育的影響

SP600125孵育受精卵20min后,胚胎置于曝氣水中常規培育。統計數據顯示,SP600125處理導致胚胎發育滯后,孵化時間較空白對照組推遲5—7h,而DMSO對照組與空白對照組相比,胚胎發育時間無明顯差異(圖1)。觀察顯示,SP600125孵育受精卵不僅影響胚胎發育進程,而且導致胚胎死亡,處理組胚胎平均存活率僅3.4%,死亡高峰出現在原腸胚期(76%)。DMSO對照組和空白對照組胚胎平均存活率分別為68.2%和90.2%。

圖1 SP600125孵育對鯽胚胎發育的影響Fig.1 The effect of SP600125 on the embryonic development of crucian carp

SP600125孵育受精卵處理組孵化后的魚苗出現大量的畸形個體,與空白對照組相比(圖2A),主要表現為心包腔水腫、頜骨畸形、脊椎彎曲甚至于尾部缺失等(圖2B—2D)。流式細胞儀倍性分析發現,與空白對照組相比較(圖2E),SP600125處理組檢測到DNA含量的改變(圖2F、2G)。然而,我們對SP600125孵育受精卵處理組存活的55尾3月齡紅鯽的DNA含量進行了測定,發現均為二倍體(圖2H)。

圖2 SP600125孵育對受精卵形態和倍性的影響Fig.2 Effects of SP600125 on morphology and ploidy of fertilized egg

2.2 SP600125浸泡魚苗對鯽發育的影響

鯽魚苗孵化出膜后即置于1.4 μmol/L SP600125溶液中持續浸泡處理7d,統計顯示處理組出現畸形魚苗占比為11.7%,而DMSO對照組和空白對照組魚苗畸形率僅為3.0%和0.9%。觀察顯示,SP600125處理7d后的畸形紅鯽主要表現為脊椎彎曲(圖3)。

2.3 SP600125孵育受精卵和魚苗對鯽骨骼發育相關基因表達的影響

信號轉導及轉錄激活因子1(Signal transducers and activators of transcription 1,stat1)、母抗Dpp小同源物6(Small mothers against decapentaplegic homolog 6,smad6)、堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子(Basic helix-loop-helix transcription factor,twist1)、信號轉導及轉錄激活因子3(Signal transducers and activators of transcription 3,stat3)、lef1、bmp2、ptk7和opg等是目前已報道的與脊椎動物骨骼發育密切關聯的功能基因[7—13]。采用熒光定量PCR分別檢測了上述8種基因在SP600125孵育受精卵后孵化的魚苗以及SP600125直接處理魚苗組的mRNA水平表達情況。如圖4A所示,與DMSO對照組和空白對照組相比較,SP600125孵育受精卵組的魚苗中stat1、smad6、ptk7、opg和stat3等5個基因mRNA表達量均有明顯升高(P＜0.05)。而在SP600125直接處理魚苗組中,除opg和stat3外,其余6個基因(stat1、smad6、lef1、bmp2、twist1和ptk7)的mRNA表達量與對照組(DMSO組和空白組)相比均有顯著差異(P＜0.05,圖4B)。

圖3 SP600125孵育鯽魚苗導致骨骼發育畸形(A和B分別為鯽胚胎出膜后3d和7d的魚苗)Fig.3 Skeletal malformations caused by SP600125 in crucian carp(A and B were 3-day and 7-day fry after hatching,respectively)

2.4 SP600125體外孵育鯽尾鰭細胞對骨骼發育基因表達的影響

在此前的研究中,Zhou等[2]將SP600125體外誘導的同源四倍體鯽細胞核移植到鯽未受精卵中,獲得的SCNT幼魚表現為尾部嚴重畸形。進一步利用熒光定量PCR技術,分別檢測了SP600125誘導的同源四倍體鯽細胞系(SP4N)和SP600125處理鯽尾鰭細胞中8種骨骼發育相關基因mRNA水平的表達情況。如圖5所示,stat1、smad6、lef1、bmp2和twist1基因在SP4N細胞中的mRNA表達量比鯽尾鰭細胞明顯增高(P＜0.05,圖5A)。在SP600125孵育鯽尾鰭細胞組中,除opg外,stat1、smad6、lef1、bmp2、twist1、ptk7和stat3等7個基因mRNA表達量與對照組細胞相比均顯著上升(P＜0.05),特別是stat1、smad6、bmp2、twist1和ptk7等5個基因表達差異尤其顯著(圖5B)

圖4 SP600126孵育對鯽骨骼發育相關基因表達的影響Fig.4 The effects of SP600125 on the expression of several skeletal development-related genes in crucian carp

3 討論

SP600125被廣泛應用于疾病發病機制研究[14,15],能促進癌細胞凋亡和抑制腫瘤的生長,并在乳腺癌[16]、淋巴瘤[17]和結腸癌[18]等得到臨床學應用。SP600125也用于治療自身免疫性疾病和神經退行性疾病[19]。此外,研究還發現,SP600125處理后能夠阻滯G2/M期而影響小鼠胚胎干細胞的增殖[20],并且對維持胚胎干細胞的干性、體外培養及胚胎干細胞的自我更新等方面都發揮顯著作用[21],在多能性干細胞誘導等方面也得到應用[22]。我們前期的研究表明,SP600125在體外具有誘導二倍體鯽細胞多倍化作用,建立了SP600125體外高效誘導魚類細胞四倍化體系,并獲得了穩定的四倍體鯽細胞系[2],這為SP600125作為新型化學誘導劑來開展多倍體培育提供了可能性。在此基礎上,本研究首次嘗試用SP600125直接孵育受精卵,結果顯示SP600125處理受精卵雖然能夠引起紅鯽倍性發生改變,但也顯著影響鯽胚胎發育并導致胚胎高死亡率,同時伴隨著大量畸形魚苗的發生,目前尚未在處理組成魚中鑒定到多倍體。

SP600125孵育鯽受精卵處理組的胚胎及魚苗中有大量的畸形個體發生,其主要表現為脊椎彎曲和尾缺失等骨骼發育異常(圖2)。SP600125處理導致骨骼畸形在SP600125孵育鯽魚苗試驗中也得以進一步驗證(圖3)。分子水平檢測結果表明,SP600125孵育影響stat1、smad6、bmp2、lef1、twist1和ptk7等一些與骨骼發育相關基因的表達。骨形態發生蛋白(Bone morphogenetic proteins,BMPs)是從脊椎動物骨骼基質中分離到的一類蛋白質,能誘導骨與軟骨形成,是促進骨形成和誘導成骨細胞分化最重要的細胞外信號分子之一[23]。蠑螈附肢再生研究中發現如果bmp2過量表達可以促進細胞凝聚和凋亡,導致再生過程中趾部的缺失[24]。lef1是骨骼發育及骨穩態的重要調節因子[25],Tommy N等[26]發現lef1基因敲除雌性小鼠顯示出成骨細胞活性降低,導致骨量的減少,而lef1過表達則會抑制晚期成骨細胞標志的表達和分化,抑制成骨細胞的終末成骨[27]。twist1在脊椎動物不同發育時期的許多組織中都有表達并且參與調控細胞命運決定、分化和成形等過程[28],研究發現twist1在成骨細胞分化及骨形成中起負性調節作用,過表達twist1抑制成骨細胞的分化[29]。而ptk7則是典型Wnt/β-catenin和非典型Wnt/PCP信號活性的關鍵調控因子,是脊椎動物胚胎模式形成和形態發生所必需的[30]。在斑馬魚研究中發現ptk7突變與脊柱側凸發生相關,ptk7缺失會導致軸向形成缺陷,包括軀干和尾巴內缺乏會聚性伸展[31]。opg基因參與調節破骨細胞的分化和活化,維持骨形成與吸收的動態平衡[32],OPG/ RANKL是非常重要的骨代謝調控通路,成骨細胞中OPG競爭性結合RANKL,抑制破骨細胞分化和骨吸收,在促進骨形成和維持骨量中起重要作用[33]。無論是在體(受精卵和魚苗)還是在離體(培養的尾鰭細胞)狀態下,SP600125孵育都會引起smad6和stat1基因mRNA水平顯著上調(圖4和圖5)。smad6是SMADs中一種抑制性信號分子,smad6對BMPs信號傳遞起抑制作用,從而負調控BMPs信號通路[34],有研究發現,smad6信號干擾能促進bmp2誘導的骨向分化[35],降低smad6的表達,可以改善大鼠骨組織病變[36]。stat1不僅參與免疫調節,還參與破骨細胞的形成和成骨細胞的分化,研究表明stat1可以通過直接與成骨細胞分化必需的轉錄因子相互作用抑制骨形成,是骨吸收和骨形成的關鍵負調控因子[37]。在小鼠骨骼間充質干細胞研究中發現過表達stat1顯著抑制成骨分化[38],而在成骨生成被抑制的小鼠中將stat1基因敲除中發現,小鼠的骨量和成骨相關因子得到顯著性恢復[37]。

圖5 SP600125誘導的同源四倍體鯽細胞系(SP4N)(A)和SP600125孵育鯽尾鰭細胞(B)中幾種骨骼發育相關基因表達Fig.5 The effects of SP600125 on the expression of several skeletal development-related genes in autotetraploid crucian carp cell line(SP4N)(A)and caudal fin cells in crucian carp(B)

綜上所述,SP600125在體孵育鯽受精卵引發胚胎(或部分細胞)多倍化效應,然而發生的骨骼發育相關基因表達改變也直接影響鯽胚胎及魚苗正常生長與發育,并導致高畸形率和高死亡率。進一步深入解析SP600125多倍化誘導分子調控機制,結合對SP600125孵育受精卵的藥物濃度和處理時長等參數的調整和優化,在實現多倍化誘導的同時減少畸形胚胎發生。此外,本研究探究的是用SP600125直接孵育受精卵(單細胞期)以獲得多倍體魚,鑒于大多數魚類前兩次卵裂基本是同步的且形成合胞體,也可以在減少嵌合體發生的前提下嘗試低濃度SP600125孵育早期胚胎(二、四細胞期),探索SP600125作為化學誘導劑開展魚類倍性操作的策略和方法。