高轉化大豆異黃酮乳酸菌的篩選及在豆乳中的發酵特性

黃玉軍，周帆，于俊娟，李穎華，顧瑞霞

（揚州大學江蘇乳品生物技術與安全控制重點實驗室，江蘇 揚州 225127）

大豆異黃酮是大豆在生長過程中形成的一種次級代謝產物，又稱植物雌激素，可以抗抑郁[1]、預防心血管疾病[2]、預防骨質疏松癥[3-4]、預防并改善乳腺癌、前列腺癌[5]、緩解更年期綜合癥、神經保護作用[6]等。已發現的大豆異黃酮有12種，其中3種為游離型苷元結構（2%～3%），能被小腸上皮直接吸收，生物活性較高，是人體可以利用的有效形式，如大豆苷元、染料木素、黃豆苷等，剩余為結合型糖苷結構（97%～98%），不能被人體小腸有效吸收，生物利用度極低（＜5%），如大豆苷、染料木苷、黃豆苷元等[7]。大豆異黃酮的形態結構是決定其生理活性和生物利用率的關鍵因素，因此，當前研究熱點主要集中于將結合型糖苷轉化為游離型苷元。

水解大豆異黃酮的酶有β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、葡萄糖酸酶、生物乳糖酶等，前人研究較多的是β-葡萄糖苷酶，可將外源糖苷轉化為相應的苷元和葡萄糖[8]。酶水解大豆異黃酮反應條件溫和，具有很強的專一性，但成本較高[9]。微生物繁殖周期不長，可以實現工業化，降低高額酶成本[10]。自然界中已發現的產β-葡萄糖苷酶的真菌有黑曲霉、紅酵母、米曲霉等，其中產β-葡萄糖苷酶效率最高的是黑曲霉。然而，大部分霉菌如黑曲霉并不是食品安全級菌株，如果要將產β-葡萄糖苷酶菌株應用于食品中，乳酸菌更為合適。食品級的乳酸菌發酵能力和微生物轉化是功能性代謝產物富集的關鍵。乳酸菌中β-葡萄糖苷酶活性較高的有干酪乳桿菌、加式乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌等[11]。

傳統乳產品銷售正在逐年下降，而植物基飲料正在沖擊市場[12]，營養與口感兼備的豆乳或將成為素食主義和乳糖不耐受人群的首選代乳產品。豆乳經發酵后既能發揮大豆的營養及功能特性，又能利用乳酸菌的益生作用產生許多大豆中原本沒有的營養物質，乳酸菌含有的β-葡萄糖苷酶還可以水解大豆異黃酮的糖苷結構向生物活性更高的游離型結構轉化，大大提高了大豆異黃酮的生物利用率。

本研究旨在篩出高轉化大豆異黃酮的乳酸菌，并研究其在豆乳中的發酵特性，實現大豆異黃酮糖苷向苷元的轉化，以增加發酵豆乳中大豆異黃酮苷元含量，提高生物活性和利用度，為研制富含功能活性物質的發酵豆乳提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料試劑

140株乳酸菌：江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室保存；大豆、白砂糖：揚州市邗江區永輝超市；七葉苷、二甲亞砜：生工生物工程（上海）股份有限公司；染料木素、大豆苷元標準品：上海源葉生物科技有限公司；檸檬酸鐵、甲醇、磷酸（色譜純）、乙腈（色譜純）：國藥集團化學試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器設備

恒溫培養箱（DNP-9272型）：上海精宏實驗設備有限公司；高壓均質機（APV1000型）：美國SPX集團；離心機（H1650-W型）：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；超純水系統（milli-Q direct 8型）：法國Millipore公司；高效液相色譜儀（1260 Infinity型）：美國Agilent Technologies公司；酸度計（PHS-3E型）：上海雷磁儀器廠；凝膠圖像分析系統（3026型）：法國VILBER公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀（Nexus+x2eco型）：德國艾本德公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳酸菌的活化

將甘油保存的供試菌株接種至MRS液體培養基中，37℃培養18 h，活化傳代2次，以保證使用前菌株的活力充分恢復。

1.3.2 產酶菌株篩選

配制七葉苷和檸檬酸鐵的特殊瓊脂培養基，在MRS液體培養基中添加質量分數0.3%的七葉苷和0.05%的檸檬酸鐵，再加1.8%的瓊脂，滅菌后在60℃左右趁熱加注250 μL到96孔板的每個孔里。等平板凝固后取培養24 h的乳酸菌液10 μL按編號次序加到96孔板中。倒置48 h培養后孔洞變成黑色的則為產β-葡萄糖苷酶菌株[13]。

1.3.3 豆乳發酵工藝

除雜→清洗→浸泡[干豆∶水=1∶3（g/mL），4 ℃，14 h]→熱燙（0.5% NaHCO3溶液，6 min）→磨漿[濕豆∶水=1∶7（g/mL）]→過濾（120目）→煮沸→均質（20 MPa）→滅菌（105℃，15 min）→冷卻→接種（1.0×107CFU/mL）→發酵（37℃發酵至pH 4.50）→冷藏（4℃，24 h）

1.3.4 豆乳發酵特性

1.3.4.1 基本理化指標

豆乳pH值：使用pH計測定；豆乳酸度：參照GB 5009.239—2016《食品安全國家標準食品酸度的測定》[14]；豆乳乳酸菌總數：參照GB 4789.35—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》[15]；

1.3.4.2 持水力測定

空白離心管質量記為W0，稱取質量W1的發酵豆乳樣品于離心管，4000r/min，離心10min，靜置10min棄上清后質量記為W2，采用如下公式計算樣品持水力[16]。

式中：W0為離心管質量，g；W1為離心前樣品和離心管總質量，g；W2為離心后樣品和離心管總質量，g。

1.3.4.3 大豆異黃酮測定

1）樣品處理

取發酵豆乳5 mL于50 mL容量瓶中，加入80%甲醇溶液至接近刻度。超聲波萃取20 min，用80%甲醇定容，搖勻取樣品溶液置于離心管中，8 000 r/min離心15 min。取上清過0.45 μm濾膜，收集濾液進高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統測定[17]。

2）色譜條件

色譜柱：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈；磷酸水溶液（pH 3.0）；流速：1.0 mL/min；紫外檢測波長：260 nm；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。梯度洗脫條件見表1。

1.3.5 乳酸菌的鑒定

將乳酸菌接種到MRS液體培養基中，37℃培養18 h，試劑盒提取乳酸菌的DNA。采用細菌鑒定的通用引物進行16S rDNA基因片段擴增，擴增完成后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到目的條帶后，擴增產物送去測序鑒定。將菌株測序結果登錄美國生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）進行序列比對，并用MEGA-X軟件繪制系統發育樹。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Conditions of gradient elution

1.4 數據分析

同一樣品平行測定3次，試驗結果為3次測定結果的平均值，采用SPSS19.0軟件處理數據，運用ANOVA進行顯著性分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 產酶菌株篩選結果

在β-葡萄糖苷酶作用下，七葉苷水解成葡萄糖和七葉素，七葉素可與Fe3+反應呈現棕黑色[18]。將實驗室保存的140株供試菌株接種于添加七葉苷和檸檬酸鐵的特殊固體培養基，培養48 h后變為棕黑色的孔，即為產酶目標菌株，根據顏色深淺初步判斷酶活高低，結果表明產酶目標菌株一共有12株，菌株編號分別為11、39、54、58、117、128、m64、m91、m113、Y-5、A28 1-2、90-2-2。

2.2 高轉化菌株復篩結果

2.2.1 發酵豆乳大豆異黃酮變化

分別將12株乳酸菌按1.0×107CFU/mL接種量接入豆乳，測定原豆乳和不同菌株發酵豆乳后大豆苷元、染料木素的含量。原豆乳、發酵豆乳高效液相色譜圖分別見圖1、圖2。

圖1 原豆乳高效液相色譜圖Fig.1 The chromatogram of HPLC of soybean milk

乳酸菌發酵產大豆異黃酮苷元的能力以發酵后豆乳中大豆苷元和染料木素的總量來表示，不同菌株發酵豆乳大豆異黃酮苷元總量如圖3所示。

圖2 發酵豆乳高效液相色譜圖Fig.2 The chromatogram of HPLC of fermented soybean milk

圖3 不同菌株發酵豆乳大豆異黃酮苷元總量Fig.3 Content of isoflavone aglycone in soybean milk fermented by different bacteria

原豆乳中大豆異黃酮苷元總量為7.15 mg/L，豆乳經產酶目標菌株發酵后大豆異黃酮苷元總量均有顯著提高（P＜0.05）。翟清燕等[19]將不同菌株用于發酵豆乳，得到一株大豆異黃酮苷元產量最高的乳酸菌，約為原豆乳的8倍。本研究中，有7株乳酸菌發酵后大豆異黃酮苷元總量在55 mg/L以上，其中產大豆異黃酮苷元能力最強的是菌株58，顯著高于除菌株m91外的10株菌。菌株58發酵后大豆異黃酮苷元總量達59.64 mg/L，約為原豆乳的8.25倍，菌株m91次之，總量達58.06 mg/L，約為原豆乳的8.12倍。菌株128、m113發酵產大豆異黃酮苷元能力最弱，發酵后大豆異黃酮苷元總量不到45.00 mg/L。

2.2.2 發酵豆乳基本特性

2.2.2.1 發酵豆乳pH值變化

以pH值降至4.50為發酵終點，12株乳酸菌發酵過程中pH值變化見圖4。

如圖4所示，菌株128、A28 1-2、m113和58發酵豆乳樣品pH值下降趨勢明顯，到達發酵終點（pH 4.50）用時較短，均小于12 h，菌株11、54和39發酵豆乳樣品到達發酵終點用時次之。菌株m64、117和m91發酵豆乳樣品pH值下降速率緩慢，到達發酵終點均在18 h以后。乳酸菌營養要求苛刻，自身蛋白水解能力較弱，因此單獨發酵時間較長是一種較普遍的現象[20-21]。

圖4 不同菌株發酵豆乳pH值變化Fig.4 pH change of soybean milk fermented by different strains

2.2.2.2 發酵豆乳酸度變化

以pH值降至4.50為發酵終點，12株乳酸菌發酵過程中酸度變化見圖5。

圖5 不同菌株發酵豆乳酸度變化Fig.5 Acidity change of soybean milk fermented by different strains

可滴定酸度反應了包括肽段和游離氨基酸殘基在內的所有酸性基團的總和[22]。如圖5所示，除菌株54發酵豆乳樣品外，另外11株乳酸菌的發酵豆乳樣品酸度均為30.00°T以上，所有乳酸菌發酵豆乳樣品的酸度在3 h后上升趨勢明顯。菌株58到達發酵終點的酸度最高，為35.01°T，菌株90-2-2、m91發酵豆乳樣品的酸度稍低于菌株 58，分別為 34.38 °T，34.01 °T。菌株54發酵豆乳樣品的酸度最低，為29.89°T。豆乳中糖類主要是水蘇糖、棉子糖和蔗糖，缺少乳酸菌生長所需的乳糖，乳酸菌不能大量生長繁殖而產生足夠乳酸，因此發酵豆乳酸度偏低[23]。

2.2.2.3 發酵豆乳活菌數

以pH值降至4.50為發酵終點，12株乳酸菌發酵前后豆乳活菌數變化見圖6。

圖6 不同菌株發酵豆乳活菌數變化Fig.6 Viable count of soybean milk fermented by different strains

發酵豆乳中乳酸菌活菌數在出廠期須達106CFU/mL以上[24]，如圖6所示，發酵初12株乳酸菌發酵豆乳樣品活菌數無顯著性差異，而發酵末活菌數都顯著提高（P＜0.05）。其中，菌株A28 1-2發酵豆乳樣品活菌數變化值最大，發酵末活菌數最高，達8.84 lg（CFU/mL），菌株58發酵末活菌數為8.78 lg（CFU/mL），顯著高于菌株 m91，菌株m91為8.55 lg（CFU/mL）。菌株m64發酵豆乳樣品活菌數變化值最小，發酵末活菌數最低，僅8.39 lg（CFU/mL）。

2.2.2.4 發酵豆乳持水力

以pH值降至4.50為發酵終點，12株乳酸菌發酵豆乳持水力見圖7。

圖7 不同菌株發酵豆乳持水力Fig.7 Water holding capacity of soybean milk fermented by different strains

如圖7所示，除菌株11、54、m64，另外9株菌的發酵豆乳樣品持水力都達30.00%以上。其中，菌株58發酵豆乳樣品的持水力顯著高于除菌株A28 1-2的另外10株菌，持水力為35.10%，菌株A28 1-2次之，持水力為34.70%。菌株11發酵豆乳樣品持水力最低，僅為29.17%。發酵豆乳持水力是由蛋白質三維網狀結構的凝膠狀態形成的，蛋白質是將流動性較好的豆乳轉化為半固態發酵豆乳的微觀物質基礎[25]。持水力低可導致乳清析出，影響產品感官及風味殘留。

2.3 優選乳酸菌鑒定結果

根據菌株發酵豆乳后大豆異黃酮苷元含量高低，并結合其發酵特性分析，故選用菌株58為高轉化大豆異黃酮優選乳酸菌。將純度符合要求的優選乳酸菌DNA進行PCR擴增，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物濃度。檢測結果如圖8所示，菌株在1 500 bp左右出現非常清晰的條帶，無特異性擴增，且亮帶無彌散、拖尾現象。

圖8 PCR擴增產物凝膠電泳圖Fig.8 Gel electrophoresis for PCR

將菌株58的16S rDNA基因序列與GenBank種的序列進行比對，發現與乳桿菌屬成員具有較高的序列相似性，用Neighbor Joining方法構建的系統發育樹如圖9所示。表明菌株58與植物乳桿菌種親緣關系密切，序列相似性達100%，因此，根據16S rDNA基因序列和系統發育分析，將菌株58初步鑒定為植物乳桿菌。

圖9 菌株58和相關細菌16S rDNA基因序列系統發育樹Fig.9 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain 58 and related strains

3 結論

本研究在140株人源乳酸菌中篩出12株產β-葡萄糖苷酶菌株，利用12株產酶目標菌株發酵豆乳，比較不同菌株發酵豆乳產大豆異黃酮苷元的能力，得出2株高轉化大豆異黃酮菌株58和m91，發酵后大豆異黃酮苷元含量均是原豆乳的8倍以上，分別為59.64、58.06 mg/L。對乳酸菌在豆乳中發酵特性的分析發現，菌株58無論是從產酸速率，發酵末活菌數[8.78 lg（CFU/mL）]和持水力（35.10%）方面均顯著優于其余菌株。經16S rDNA測序鑒定，優選菌株58為植物乳桿菌。高轉化大豆異黃酮乳酸菌的篩選及其應用可實現發酵豆乳中大豆異黃酮糖苷向高生物活性和利用度大豆異黃酮苷元的轉化，對提高發酵豆乳功能營養特性具有重要的指導意義，其發酵轉化大豆異黃酮最佳條件值得進一步探究并完善。