馬甲子總三萜的HPLC指紋圖譜建立、聚類分析和主成分分析及含量測定

陳旺 詹雁 王美慧 譚鐳 徐超群

摘 要 目的：建立馬甲子總三萜的指紋圖譜，進行聚類分析和主成分分析，并測定其中主要成分馬甲子素的含量。方法：采用高效液相色譜法（HPLC）。色譜柱為Agilent PheHex，流動相為甲醇-0.05%磷酸水溶液（梯度洗脫），檢測波長為320 nm，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為5 μL。以馬甲子素為參照，繪制10批馬甲子總三萜的HPLC指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》進行相似度評價，確定共有峰;采用SPSS 26.0軟件進行聚類分析和主成分分析。采用同一HPLC法測定馬甲子素的含量。結果：10批馬甲子總三萜共有6個共有峰，相似度均大于0.990;指認馬甲子素1個特征峰。聚類分析結果顯示，10批馬甲子總三萜樣品可聚為4類，其中S1為一類、S2為一類、S3～S6為一類、S7～S10為一類。主成分分析結果顯示，前2個主成分的累積方差貢獻率為99.430%。綜合評分由高到低依次為S1>S9>S8>S7>S10>S2>S3>S5>S6>S4。馬甲子素檢測質量濃度的線性范圍為33.7～844.0 μg/mL（r=0.999 9）;精密度、重復性、穩定性（24 h）試驗的RSD均小于2%，平均加樣回收率為99.75%（RSD=1.13%，n=6）;10批馬甲子總三萜樣品中馬甲子素的平均含量為0.576%～0.712%。結論：所建HPLC指紋圖譜和含量測定方法穩定、可靠，可用于馬甲子的質量控制。

關鍵詞 馬甲子總三萜;馬甲子素;高效液相色譜法;相似度評價;聚類分析;主成分分析;指紋圖譜;含量測定

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish fingerprint of Paliurus ramosissimus total triterpenes， and to conduct cluster analysis and principal component analysis， and to determine the content of the main component paliurusene. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent PheHex column with mobile phase consisted of methanol-0.05% phosphoric acid solution （gradient eluetion） at the flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was set at 320 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 5 μL. Using paliurusene as reference， HPLC fingerprints of 10 batches of? ? ? P. ramosissimus total triterpenes were drawn. Similarity evaluation was performed by using TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System （2012 edition）， and the common peaks were confirmed. Cluster analysis and principle component analysis were performed by using SPSS 26.0 software. The content of paliurusene was determined by same HPLC method. RESULTS： There were totally 6 common peaks in HPLC fingerprint of 10 batches of P. ramosissimus total triterpenes. The similarity was more than 0.990; one of six common peaks was identified as paliurusene. The results of cluster analysis showed that 10 batches of samples could be clustered into 4 categories， including S1， S2， S3-S6 and S7-S10. The results of principal component analysis showed that the accumulative variance contribution rate of primary 2 principal components was 99.430%. Comprehensive score ranking was S1>S9>S8>S7>S10>S2>S3>S5>S6>S4. The linear range of paliurusene concentration was 33.7-844.0 μg/mL（r=0.999 9）. RSDs of precision， reproducibility and stability （24 h） tests were all lower than 2%. Average recovery was 99.75%（RSD=1.13%，n=6）. The average contents of paliurusene in 10 batches of P. ramosissimus total triterpenes was 0.576%-0.712%. CONCLUSIONS： Established HPLC fingerprint and content determination method are reliable and stable， and can be used for the quality control of P. ramosissimus.

KEYWORDS? ?Paliurus ramosissimus total triterpenes;? Paliurusene; HPLC; Similarity evaluation; Cluster analysis; Principal component analysis; Fingerprint; Content determination

中圖分類號 R284 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）02-0201-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.02.13

馬甲子為鼠李科植物馬甲子屬馬甲子Paliurus ramosissimus（Lour.）Poir的葉，在《中華本草》[1]和《中藥大辭典》[2]中均有記載。其性平、味苦，無毒，具有祛風濕、消腫止痛、解毒等功效，可用于治療風濕痹痛、跌打損傷、咽喉腫痛、癰疽潰膿等癥[3]。有文獻報道，馬甲子主要含有三萜類、黃酮類、環肽生物堿類等成分[4-6]，具有抗腫瘤、抗炎、抗潰瘍、鎮咳祛痰等作用[7-10]。韋國鋒等[10]研究發現，馬甲子乙醇提取物的止咳祛痰效果優于馬甲子水提物。何穎等[11]發現，馬甲子葉醇提物的正丁醇部位能顯著降低角叉膠致胸膜炎模型大鼠體內的丙二醛（MDA）、前列腺素E2（PGE2）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）水平，具有明顯的抗炎作用。本課題組前期對馬甲子總三萜類化合物純化工藝以及生物活性研究的結果顯示，其植株中所含的五環三萜類衍生物群是該藥產生體外抗腫瘤活性的關鍵化合物，因此對馬甲子總三萜化合物進行質量檢測是保證其藥理活性的關鍵[12-15]。目前，關于馬甲子的研究多集中在新劑型[16-18]、藥理作用[8-11]以及農業園藝[19-22]等方面，有關其化學成分的研究相對較少;此外，目前尚無馬甲子總三萜的質量標準，且該藥材尚未被2020版《中國藥典》或相關藥品標準收錄?；诖?，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）建立了馬甲子總三萜的指紋圖譜，并進行聚類分析和主成分分析;同時檢測其主要成分馬甲子素[7]的含量，旨在為其質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

分析所用儀器為：Agilent 1260 型HPLC儀（包括二極管陣列檢測器、二元泵、自動進樣器及配套液相色譜工作站，美國Agilent公司）、XS205 DualRange型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）、RE-52AA型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）、DZF-6050型真空干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）、SB5200D型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）、玻璃層析柱（成都市凌云玻璃儀器廠，規格3.3 cm×60 cm）、AB-8型大孔吸附樹脂（粒徑300～1 250 mm，滄州寶恩吸附材料科技有限公司）等。

1.2 藥品與試劑

所用藥品與試劑為：馬甲子素對照品（成都普思生物科技股份有限公司，批號20150801，純度≥98%）、馬甲子總三萜粉末（由S11馬甲子藥材按前期研究方法[15]制得，得率為0.60%，馬甲子素含量為1.269 2%，用于含量測定方法學考察）等;甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為純凈水。

11批馬甲子藥材（編號S1～S11），經四川省中醫藥科學院舒光明研究員鑒定為鼠李科馬甲子屬馬甲子P. ramosissimus（Lour.）Poir的鮮葉。樣品信息來源見表1。

2 方法與結果

2.1 馬甲子總三萜HPLC指紋圖譜的建立

2.1.1 供試品溶液的制備 取10批藥材（編號S1～ S10），按前期研究方法[15]制得馬甲子總三萜粉末（平均得率為0.60%）。取上述馬甲子總三萜粉末0.1 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加甲醇定容，稱定質量，超聲（功率250 W，頻率50 kHz）處理10 min，冷卻至室溫，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.2 對照品溶液的制備 取馬甲子素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度為0.8? mg/mL的對照品溶液，置于4 ℃冰箱中避光密封保存，備用。

2.1.3 色譜條件 以Agilent PheHex（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）為色譜柱;以甲醇（A）-0.05%磷酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～30 min，0→74%A;30～50 min，74%A→100%A）;檢測波長為320 nm;流速為1 mL/min;柱溫為30 ℃;進樣量為5 μL。

2.1.4 精密度試驗 取“2.1.1”項下供試品溶液（編號S1）適量，按“2.1.3”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。以馬甲子素峰為參照（S），計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，6個共有峰相對保留時間的RSD為0.056%～0.108%（n=6），相對峰面積的RSD為0.089%～2.308%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.1.5 穩定性試驗 取“2.1.1”項下供試品溶液（編號S1）適量，分別于室溫下避光放置 0、2、4、8、12、24 h時按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以馬甲子素峰為參照（S），計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，6個共有峰相對保留時間的RSD為0.037%～0.184%（n=6），相對峰面積的RSD為0.066%～2.330%（n=6），表明供試品溶液于室溫下避光放置24 h內穩定性良好。

2.1.6 重復性試驗 取同法制備的馬甲子總三萜粉末（編號S1）0.1 g，共6份，精密稱定，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以馬甲子素峰為參照（S），計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，6個共有峰相對保留時間的RSD為0.089%～0.223%（n=6），相對峰面積的RSD為0.078%～2.381%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.1.7 馬甲子總三萜HPLC指紋圖譜的建立 取同法制備的10批馬甲子總三萜粉末（編號S1～S10），按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，將色譜數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》，得到馬甲子總三萜樣品的疊加指紋圖譜，詳見圖1。

2.1.8 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》對10批馬甲子總三萜樣品（編號S1～S10）的指紋圖譜進行相似度評價，采用多點校正方法對各色譜峰進行全峰匹配，生成馬甲子總三萜對照圖譜（圖1中的“R”曲線）。結果，10批樣品相似度均大于0.990，詳見表2。

2.1.9 共有峰指認 根據馬甲子總三萜的HPLC疊加指紋圖譜生成結果，得到6個共有峰;通過與馬甲子素對照品色譜圖（圖2A）進行對比，指認4號峰為馬甲子素。因馬甲子素色譜峰分離度較好、峰面積較大，故以其為參照峰（S）計算其余共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果見表3、表4。

2.2 聚類分析

將10批馬甲子總三萜粉末樣品（編號S1～S10）指紋圖譜中的6個共有峰峰面積經過標準化處理后，采用SPSS 26.0 軟件，以組間平均數連接法、平方Euclideam距離為度量標準進行聚類分析。結果，10批馬甲子總三萜樣品可聚為4類，其中S1聚為一類、S2聚為一類、S3～S6聚為一類、S7～S10聚為一類，詳見圖3。

2.3 主成分分析

采用SPSS 26.0 軟件對10批馬甲子總三萜樣品的6個共有峰標準化的峰面積進行主成分分析。結果，共提取了2個主成分，這2個主成分的累積方差貢獻率為99.430%，提示其可以反映馬甲子總三萜樣品中的大部分信息，詳見表5。

采用SPSS 26.0軟件對6個共有峰標準化的峰面積進行因子載荷矩陣。結果，第1主成分特征值為4.004，方差貢獻率為66.725%;成分3、4（馬甲子素）、5、6在第1主成分上有較高載荷，表明第1主成分主要反映了這4個成分的信息。第2個主成分特征值為1.962，方差貢獻率為32.705%，累積方差貢獻率為99.430%，主要反映成分1、2的信息，詳見表5、表6。

主成分載荷矩陣（也稱主成分系數）不等同于因子載荷矩陣，其可通過因子載荷矩陣計算得到，根據表6結果按公式計算，Ui=Ai/λ[23]（式中，Ui為主成分系數，Ai為因子載荷矩陣，λ為特征值），結果見表7。

每一個載荷量表示主成分與對應變量（標準化后的峰面積，以A表示）的系數，第1主成分的線性關系式為Y1=0.164A1+0.279A2+0.492A3+0.468A4+0.489A5+0.442A6，第2主成分的線性關系式為Y2=0.671A1+0.586A2+0.122A3-0.251A4-0.143A5-0.330A6;綜合得分（Y）=（66.725%×Y1+32.705%×Y2）/99.430%;綜合得分越高，表示質量越好[24]。結果，10批樣品中，重慶潼南（S1）最優，四川德陽羅江縣（S9）和四川彭州（S8）較佳，詳見表8。

2.4 馬甲子素的含量測定

2.4.1 溶液的制備 取“1.2”項下馬甲子總三萜粉末適量，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項下方法制備對照品溶液，以甲醇為空白溶液。

2.4.2 色譜條件 色譜條件同“2.1.3”項。

2.4.3 系統適用性試驗 取上述對照品溶液、空白溶液（甲醇）、供試品溶液適量，按“2.4.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，各色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數以馬甲子素計均不低于5 000，詳見圖2。

2.4.4 線性關系考察 精密吸取“2.4.1”項下對照品溶液，加甲醇稀釋，制成質量濃度分別為33.7、84.4、168.8、422.0、844.0 μg/mL的線性工作溶液，按“2.4.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果，馬甲子素的回歸方程為Y=3 266.8X+0.732 8（r=0.999 9），表明馬甲子素檢測質量濃度的線性范圍為33.7～844.0 μg/mL。

2.4.5 精密度試驗 取“2.4.1”項下供試品溶液適量，按“2.4.2”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，馬甲子素峰面積的RSD為0.79%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.4.6 重復性試驗 取“1.2”項下馬甲子總三萜粉末0.1 g，精密稱定，共6份，按“2.4.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.4.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品含量。結果，馬甲子素含量的RSD為1.02%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.4.7 穩定性試驗 取“2.4.1”項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置 0、2、4、8、12、24 h時按“2.4.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，馬甲子素峰面積的RSD為0.31%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗 取“1.2”項下馬甲子總三萜粉末0.1 g，共6份，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加入“2.4.4”項下質量濃度為844 μg/mL的線性工作溶液10 mL，按“2.4.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表9。

2.4.9 樣品含量測定 取10批同法制備的馬甲子總三萜樣品，按“2.4.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.4.2”項下色譜條件進樣測定（平行測定3次），記錄峰面積并按外標法計算樣品含量，結果見表10。

3 討論

本研究前期對Agilent SB-C18（150 mm×4.6 mm，2.7 μm）、Agilent PheHex（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）、Agilent PheHex（150 mm×4.6 mm，2.7 μm）等不同色譜柱的分離效果進行了考察。結果，以Agilent PheHex（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）為色譜柱時的色譜峰峰形、分離度均較好，出峰數量較多，色譜信息較全面，故選擇Agilent PheHex（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）為色譜柱。同時，本課題組還比較了乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.05%磷酸水溶液等流動相的分離效果。結果，以甲醇-0.05%磷酸水溶液為流動相進行梯度洗脫時，各色譜峰出現時間適宜且峰形對稱、分離度好、基線漂移小，故選擇甲醇-0.05%磷酸水溶液為流動相進行梯度洗脫。此外，本研究采用二極管陣列檢測器對不同檢測波長（210、230、260、290、320、350、380 nm）進行了考察。結果，當檢測波長為320 nm處時，各色譜峰分離度較好，響應值較高且馬甲子素峰在此波長下有較大吸收，故選擇320 nm為檢測波長。

本研究前期發現，廣西桂林全州縣白寶鎮產馬甲子藥材中的馬甲子素含量相對較高，故以其為樣品進行含量測定的方法學考察，對另外10批樣品進行指紋圖譜、聚類分析和主成分分析以及定量測定。本研究指紋圖譜分析結果顯示，10批馬甲子總三萜中有6個共有峰，且相似度均大于0.990。這提示不同來源的馬甲子總三萜樣品中的特征峰有較高的一致性。通過與對照品比對，指認4號峰為馬甲子素。聚類分析結果顯示，10批馬甲子總三萜樣品可聚為4類，其中S1聚為一類、S2聚為一類、S3～S6聚為一類、S7～S10聚為一類。主成分分析結果顯示，2個主成分的累積方差貢獻率為99.430%，可代表馬甲子總三萜樣品指紋圖譜的大部分信息;其中，重慶潼南柏梓鎮、四川德陽羅江縣、四川彭州天彭鎮等地區產馬甲子藥材的綜合質量較好。10批馬甲子總三萜樣品中馬甲子素的平均含量為0.576%～0.712%，以重慶潼南柏梓鎮產馬甲子的馬甲子素含量最高，其他地區藥材樣品中馬甲子素含量有所差異，可能與不同產地的環境、氣候及采收時間有關[25]。

綜上所述，所建HPLC指紋圖譜和含量測定方法穩定、可靠，可用于馬甲子藥材的質量控制。

參考文獻

[ 1 ] 國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草：第十三卷[M].上海：上?？茖W技術出版社，1999：242-245.

[ 2 ] 南京中醫藥大學.中藥大辭典：上冊[M].上海：上?？茖W技術出版社，2014：364-365.

[ 3 ] 朱華，張可鋒，高雅，等.馬甲子的生藥學研究[J].廣西中醫藥，2008，31（1）：56-57.

[ 4 ] 于磊，張東明.鐵籬巴果化學成分的研究[J].中國中藥雜志，2006，31（24）：2049-2052.

[ 5 ] LEE SS，SU WC，LIU KC，et al. Cyclopenptide alkaloids from stems of Paliurus ramosissimus[J]. Phytochemistry，2001，58（8）：1271-1276.

[ 6 ] 陳晨.馬甲子化學成分的研究[D].揚州：揚州大學，2016.

[ 7 ] 王京.馬甲子總三萜生物學性質研究[D].成都：成都中醫藥大學，2018.

[ 8 ] 白筱璐，周靜，胡竟一，等.馬甲子對實驗性結腸炎的干預及Th1/Th2漂移相關作用機理研究[J].中藥藥理與臨床，2019，35（4）：116-119.

[ 9 ] 余悅，周靜，陳健，等.馬甲子誘導AGS/人胃腺癌細胞凋亡的研究[J].中藥藥理與臨床，2019，35（5）：56-60.

[10] 韋國鋒，覃道光，黃志文.馬甲子鎮咳祛痰作用的研究[J].數理醫藥學雜志，1999，20（2）：3-5.

[11] 何穎，辜義陸，歐麗蘭，等.馬甲子葉抗炎有效部位的篩選及其機理初探[J].中藥材，2015，38（12）：2586-2589.

[12] 武蕊娟，譚鐳，詹雁，等.馬甲子葉提取物抗腫瘤活性部位的篩選[J].世界中醫藥，2016，11（2）：324-326.

[13] 高媛，宋聯強，樊梅，等.馬甲子葉提取物的抗腫瘤活性研究[J].華西藥學雜志，2015，30（3）：303-305.

[14] 謝瑩.馬甲子的提取純化工藝及其特性研究[D].成都：成都中醫藥大學，2017.

[15] 王京，阮佳，徐超群.大孔樹脂純化馬甲子五環三萜類成分的工藝研究[J].天然產物研究與開發，2018，30（4）：697-701、574.

[16] 任娟.馬甲子總三萜固體分散體的制備與評價[D].成都：成都中醫藥大學，2019.

[17] 盧辛未.馬甲子抗腫瘤物質基礎及其膠囊劑的制備[D].成都：成都中醫藥大學，2017.

[18] 武蕊娟.馬甲子抗腫瘤活性部位的篩選及其制劑工藝的研究[D].成都：成都中醫藥大學，2016.

[19] 鄧定洪.果園保護神：馬甲刺[J].農村新技術，2009（3）：29.

[20] 供應圍園“鐵籬笆”：馬甲子[J].農村新技術，2008（21）：77.

[21] 張鋤亮.馬甲子育苗與栽培技術[J].農村新技術，2006（3）：10.

[22] 張鋤亮.植物鐵籬笆：馬甲子[J].農家科技，2006（2）：32.

[23] 康念欣，袁炎炎，張瀟，等.酒黃連HPLC特征圖譜的建立及聚類分析和主成分分析[J].世界科學技術：中醫藥現代化，2020，22（8）：2790-2798.

[24] 李國衛，何民友，孫冬梅，等.基于主成分分析及聚類判別模式的積雪草藥材UPLC指紋圖譜研究[J].廣東藥科大學學報，2020，36（1）：10-17.

[25] 楊柳，康顯杰，杜偉鋒，等.產地海拔等對前胡中白花前胡甲、乙含量的影響[J/OL].中華中醫藥學刊，2020.[2020-11-17]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/21.1546.R.202011-17.1203.004.html.

（收稿日期：2020-09-17 修回日期：2020-12-04）

（編輯：陳 宏）