基于蛋白質組學分析羊乳、牛乳和人乳的蛋白質功能特性

任 榮，楊博睿，彭海帥，王畢妮*，張富新，惠媛媛，賈 蓉

（陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710062）

乳類物質是一種營養豐富的理想食品，富含人體生長發育的必需氨基酸、短中鏈脂肪酸以及鉀、磷、鈣和其他礦物質[1]。人類食用乳及乳制品的歷史悠久，早在古代李時珍所著的《本草綱目》就指出：奶汁主治補五臟，令人肥白悅澤、益氣、治瘦悴、悅皮膚、潤毛發[2]。乳中營養成分的含量和種類受遺傳、生理及環境條件等影響，其中產乳動物的品種多樣化一定程度影響乳中蛋白質合成水平、肽鏈的磷酸化和糖基化及氨基酸序列[3]。目前，市場上的乳及乳制品主要以牛乳和羊乳為原料，其他小眾乳在特定區域同樣具有重要的營養和經濟價值，例如駝乳、馬乳、驢乳、鹿乳等，其口味和營養成分也因種類、飼料、環境和擠乳環境等有很大差異[4]。

奶牛養殖規模大、產量高、品種豐富，牛乳已成為越來越多消費者生活中必不可缺的飲食選擇。近年來，隨著羊乳的營養價值逐漸被更多的消費者所認知，羊乳市場不斷擴大，世界羊乳消費量總體上持續增長[5]。牛乳中蛋白質種類較多，酪蛋白和葉酸含量均較高；而羊乳中脂肪球較小，含有更多的不飽和脂肪酸、礦物質和維生素等營養因子[6]。牛乳和羊乳作為乳品行業開發和研究的主要乳源，研究者們在研發嬰幼兒乳粉時也一直致力于調整其營養成分，使其更接近于人乳，從而確保嬰兒的腸道消化和營養吸收。蛋白質作為乳中的關鍵成分，具有多種分子功能。例如，酪蛋白膠束提供對能量、組織生長和細胞功能至關重要的必需氨基酸。此外，一些蛋白質可以作為激素或抗菌物質等[7]。因此研究不同品種乳中蛋白質表達的差異，可以在分子層面上深入了解相應的營養特性，獲得特定的蛋白質生物標志物，為消費者健康飲食提供指導。

蛋白質組學是解析蛋白質成分的主要技術手段。自20世紀90年代將蛋白質組學應用于牛乳研究，鑒定了6 種主要蛋白質及其遺傳變異體外，取得了重大進展。目前國內外的蛋白質組學技術已經十分成熟，能夠檢測、識別和量化蛋白質，如生物活性肽[8]、乳清蛋白[9]及乳脂肪球膜蛋白[10]。關于蛋白質組學的基礎應用以及在哺乳期、乳品加工和貯藏期間蛋白質的變化，已經有許多相關研究報道[11-13]。本研究通過研究羊乳、牛乳和人乳的基本成分，并通過超高效液相色譜-串聯質譜（ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）技術對3 種乳中所含有的蛋白質進行分析，通過基因本體論（gene ontology，GO）注釋、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數據庫及蛋白質相互作用網絡分析不同品種乳中的蛋白質富集程度及所發揮的分子功能，探究可能影響其品質的潛在關鍵蛋白，為后續蛋白質調控研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊乳取自飼養于西北農林科技大學實驗農場的30 只Saanen山羊；牛乳采自西安銀橋乳業公司飼養的30 只黑白花乳牛；人乳由西安市3 名處于哺乳期的女性志愿者提供。采樣時充分混合，-80 ℃貯藏。

尿素、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘代乙酰胺 美國Sigma公司；甲酸、乙腈、四乙基溴化銨（tetraethyl-ammonium bromide，TEAB） 美國Fisher Chemical試劑公司；蛋白酶抑制劑、胰蛋白酶 美國Promega試劑公司；BCA試劑盒 上海碧云天生物技術公司。

1.2 儀器與設備

ZORBAX 300 Extend C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）美 國A g i l e n t公 司；F D U-1 2 0 0真 空 冷 凍干燥機 上海愛朗儀器有限公司；UPLC系統（EASYnLC 1000）、Q ExactiveTMPlus組合型四極桿-OrbitrapTM質譜儀 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 乳成分分析

樣品室溫解凍后，利用乳成分分析儀測定羊乳、牛乳和人乳中的蛋白質、脂肪、乳糖、礦物質、干物質含量，重復測定3 次。

1.3.2 蛋白溶液制備

上述解凍后的乳樣3 500 r/min離心10 min，去除上層脂肪，余下清液和蛋白質沉淀混合均勻。準確吸取100 μL，加入400 μL裂解緩沖液（含8 mol/L尿素、1 g/100 mL蛋白酶抑制劑），在細胞破碎儀中400 W超聲裂解20 s，12 000×g低溫離心10 min，收集上清液轉移至新的潔凈離心管，按照BCA試劑盒說明書步驟測定各樣品總蛋白質含量。

1.3.3 蛋白質酶解消化

取50 μL 1.3.2節所得上清液，加入等體積25 mmol/L NH4HCO3溶液（含10 mmol/L DTT），56 ℃水浴30 min進行蛋白質還原反應；反應完成后將混合液取出冷卻至室溫，迅速加入等體積0.1 mol/L烷基化試劑（25 mmol/L NH4HCO3溶液，含55 mmol/L碘代乙酰胺），室溫下暗反應30 min；最后通過添加0.1 mol/L TEAB緩沖溶液將每個樣品溶液尿素濃度稀釋至2 mol/L，以胰蛋白酶與蛋白質質量比1∶100添加胰蛋白酶，37 ℃酶解消化3 h，再以質量比1∶50加入胰蛋白酶，2 次消化過夜。消化完成后向混合體系中添加50 μL體積分數1%甲酸溶液終止酶解反應，4 ℃、12 000×g離心10 min，得到酶切肽段上清液[14]。

1.3.4 肽段純化

肽段上清液用反相UPLC分級，色譜柱為Agilent 300 Extend C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。肽段分級流動相梯度設置為8%～32%乙腈、pH 9.0，1 h內分離出60 個組分，合并為4 組，再經真空冷凍干燥后保存在-80 ℃冰箱內，待測[15]。

1.3.5 UPLC-MS/MS分析

肽段使用EASY-nLC 1000 UPLC系統進行分離，電離后在Q ExactiveTMPlus質譜儀中進行分析。分析條件參考周玉成等[16]的方法，其中掃描條件作出一定調整：一級質譜掃描范圍m/z350～1 800，掃描分辨率70 000；二級質譜掃描范圍m/z200，掃描分辨率17 500。

1.3.6 NCBI數據庫搜索

使用Maxquant搜索引擎（http://www.maxquant.org/）檢索NCBICapra hircus數據庫，胰蛋白酶被指定為裂解酶，缺失裂解數目設置為2。一級母離子的質量容限設置為20 Da，二級碎片離子的質量容限設置為0.02 Da。半胱氨酸上的烷基化設為固定修飾，甲硫氨酸的氧化、蛋白N端的乙?；?、天冬酰胺和谷氨酰胺的脫酰胺化均設為可變修飾。錯誤發現率（false discovery rate，FDR）均調整為＜1%，肽段的最低分數設置為＞40。

1.3.7 生物信息學分析

GO注釋蛋白質組來源于UniProt-GOA數據庫（http://www.ebi.ac.uk/GOA/）。InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）將用作某些未注釋蛋白質的替代軟件。通過GO注釋將蛋白質分為3 類：生物過程、細胞成分和分子功能。KEGG數據庫用于蛋白質通路的注釋和富集分析。以數據庫中的所有蛋白質為對照，檢驗鑒定出的蛋白質的富集程度，根據KEGG網站通路層級分類方法將通路進行分類。在STRING數據庫（https://version-10-5.string-db.org/）搜索對比所有已識別的蛋白質數據庫編號或序列，按照Confidence Score＞0.7（high confidence）提取得到鑒定蛋白的相互作用關系。然后，使用R包的networkD3工具（https://cran.r-project.org/web/packages/networkD3/）進行蛋白質相互作用網絡的識別可視化。對于每個類別，均采用雙尾Fisher精確檢驗，富集檢驗P＜0.05則認為差異顯著。

1.4 數據處理

結果均以平均值±標準差的形式表示。使用IBM SPSS Statistics 22軟件進行統計分析，測試方法設置為單因素方差分析，Duncan’s test作多重比較，采用雙尾Fisher精確檢驗，P＜0.05定義為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 羊乳、牛乳和人乳的基本成分分析

表 1 羊乳、牛乳和人乳的基本成分Table 1 Basic components of goat milk, cow milk, and human milk%

由表1可知，3 種乳樣在基本成分含量上有較大差別，羊乳和牛乳的蛋白質含量和礦物質含量均顯著高于人乳（P＜0.05）。人乳的蛋白質含量雖然較少，但是其分子質量較高，必需氨基酸種類豐富，還含有豐富的生物活性成分，如表皮生長因子、胰島素樣生長因子1、環核苷酸及乳鐵蛋白等，能夠滿足人體生長所需；羊乳和人乳的脂肪含量較高，顯著高于牛乳（P＜0.05），其中人乳中的不飽和脂肪酸含量較高，能促進嬰幼兒的智力發育[17]；乳糖是乳中含量最高的營養成分，人乳中乳糖含量最高，大約為6.92%（P＜0.05）。雖然3 種乳蛋白質、脂肪、乳糖和礦物質含量有一定差異，但干物質含量基本維持在12.00%以上，并且無顯著差異。研究發現，乳中的αs1-酪蛋白和β-乳球蛋白是引起蛋白質過敏反應的2 種蛋白，與牛乳相比，羊乳中含有較低含量的αs1-酪蛋白和β-乳球蛋白，而這2 種過敏原在人乳中含量極低，這也是羊乳有利于緩解人體乳糖不耐受癥的主要原因[18-19]。

2.2 羊乳、牛乳和人乳中蛋白質的鑒定

圖 1 羊乳、牛乳和人乳中鑒定出的蛋白種類韋恩圖Fig. 1 Venn diagram of unique and shared proteins among goat milk,cow milk, and human milk

本研究通過UPLC-MS/MS技術，對3 種乳樣進行非標記性蛋白質組研究，并且對所有鑒定到的蛋白質進行蛋白注釋、功能分類和功能富集分析。由圖1可知，在羊乳、牛乳和人乳中共鑒定出3 370 種蛋白質，包括1 023 種羊乳蛋白、789 種牛乳蛋白和1 558 種人乳蛋白。其中，共307 種蛋白質在3 種乳間共有。人乳中的蛋白質種類明顯高于羊乳和牛乳，這可能是酪蛋白含量不同造成的，牛乳中酪蛋白含量高于羊乳和人乳，影響了某些低分子質量蛋白的表達[20]。

2.3 乳蛋白的GO注釋

GO是表達基因及其產物特性的重要生物信息學分析方法和工具，解釋了蛋白質在不同方面的生物學效應。分別對3 種乳樣中蛋白質的GO注釋情況進行統計。

圖 2 羊乳（A）、牛乳（B）和人乳（C）蛋白質的GO二級分類統計圖Fig. 2 GO secondary classification statistics of proteins in goat milk (A),cow milk (B), and human milk (C)

由圖2可知，與乳蛋白有關的生物過程主要集中在細胞過程、代謝過程、單組織過程、生理調節、應激反應、定位及信號傳導，這些生物學過程與細胞的生長和生物學應激有關。多細胞組織過程、細胞成分組織及合成、發育過程、免疫系統過程和多組織過程在牛乳和人乳中特有，而羊乳蛋白參與較少。在細胞成分分類中，牛乳蛋白主要作用于細胞和細胞器，而牛乳和人乳中的部分蛋白質在腔上包膜和細胞連接處表達水平較高。所鑒定出蛋白的分子功能主要涉及結合功能和催化活性，其余大部分與分子結構和信號轉導有關。與羊乳蛋白相比較，部分牛乳和人乳蛋白質的分子功能富集在分子轉導活性方面。羊乳、牛乳和人乳在GO分析的3 個類別上均有些許蛋白富集差異，但在生物學過程、作用位置及主要功能分布上整體一致。

2.4 KEGG通路富集分析

機體內生理功能的發揮并不是某個或某幾個蛋白質發揮作用而產生的，而是通過相互作用于某一模塊或路徑。KEGG是連接已知分子間相互作用的信息網絡，如代謝通路、復合物、生化反應。因此通過KEGG通路富集分析羊乳蛋白、牛乳蛋白及人乳蛋白的主要作用途徑。

圖 3 羊乳（A）、牛乳（B）和人乳（C）的KEGG通路富集柱狀圖Fig. 3 KEGG pathway enrichment in goat milk (A), cow milk (B), and human milk (C)

選取富集程度（-lgPval）前10的代謝通路分別作柱狀圖橫向比較，由圖3可知，羊乳蛋白中富集程度較高的代謝通路為核糖體通路（chx03010）、碳代謝通路（chx01200）和蛋白質在內質網的加工通路（chx04141），牛乳蛋白中富集程度較高的代謝通路為溶酶體通路（bta04142）、吞噬體通路（bta04145）和內吞作用通路（bta04144），人乳蛋白中富集程度較高的代謝通路為核糖體通路（hsa03010）、蛋白酶體通路（hsa03050）及蛋白質在內質網的加工通路（hsa04141）。

在羊乳、牛乳和人乳3 種乳樣中，編號04141的蛋白質在內質網的加工通路均有較高富集程度，分別有49 種羊乳蛋白、29 種牛乳蛋白及58 種人乳蛋白參與此過程。內質網對蛋白質的加工過程主要包括糖基化、羥基化、?；岸蜴I形成等，其中最主要的是糖基化過程，幾乎所有內質網上合成的蛋白質最終均被糖基化，使蛋白質能夠抵抗消化酶的作用，賦予蛋白質信號傳導的功能。因此參與該通路的蛋白質種類差異會導致蛋白質合成過程及其生理功能的改變，從而影響不同品種乳樣中最終蛋白質含量及生物效能。

2.5 羊乳、牛乳和人乳共有蛋白質相互作用分析

在生物體中，蛋白質并非孤立存在，其功能的行使必須借助于其他蛋白質的調節和介導，這種調節或介導作用的實現首先要求蛋白質之間有結合作用或相互作用。蛋白質相互作用網絡對于揭示蛋白質功能具有重要意義。例如，高度聚集的蛋白質可能具有相同或相似的功能；連接度高的蛋白質可能是影響整個系統代謝或信號轉導途徑的關鍵點。

圖 4 羊乳、牛乳和人乳共有蛋白的蛋白質相互作用網絡圖Fig. 4 Protein-protein interaction network of goat milk, cow milk,and human milk

通過STRING數據庫對羊乳、牛乳和人乳種共有的307 種蛋白質進行相互作用分析，由圖4可知，其中的關鍵蛋白質分別為丙糖磷酸異構酶1、磷酸甘油酸變位酶1、丙酮酸激酶M、磷酸甘油酸酯激酶1、果糖二磷酸醛縮酶A等，參與的關鍵通路主要為碳代謝、糖酵解/糖異生、氨基酸生物合成、白細胞跨內膜遷移等。其中磷酸甘油酸變位酶1作為糖酵解通路的重要酶之一，催化糖酵解通路中3-磷酸甘油酸轉化生成2-磷酸甘油酸，促進葡萄糖代謝和能量生成，可作為腫瘤代謝調控的新靶標，其抑制劑的研發受到越來越多的關注[21]。與熱休克蛋白8相互作用的蛋白質約有7 個，參與不同的代謝通路，熱休克蛋白8是熱休克蛋白70家族的一員，可與新生多肽結合，以促進正確折疊，熱休克蛋白8在膜蛋白包被的小泡通過細胞膜成分的轉運中起著ATP的作用[22]。因此該蛋白可作為潛在重要標志物繼續進一步分析其上調或下調后對機體的影響。

3 結 論

對羊乳、牛乳和人乳3 種乳樣進行基本成分測定，并通過非靶標UPLC-MS/MS技術對3 種乳所含蛋白質進行生物信息學定性分析。結果表明：3 種乳樣的基本成分含量有較大差別，羊乳和牛乳的蛋白質含量和礦物質含量較高，羊乳和人乳的脂肪含量較高，人乳的乳糖含量最高，干物質含量無明顯差異；蛋白質酶解消化后共鑒定出3 370 種蛋白質，GO注釋分析表明，與乳蛋白有關的生物過程主要集中在細胞和代謝過程，細胞定位在腔體和細胞器上，分子功能表現為結合功能和催化活性；KEGG通路在3 種乳中富集程度和種類有差異，共有的高富集通路為蛋白質在內質網的加工過程；蛋白質相互作用中的共有蛋白質主要集中在碳代謝、糖酵解/糖異生、氨基酸生物合成等通路，對這些蛋白質的功能和作用機制進行深入研究，可以為羊乳、牛乳和人乳互補、提高機體營養吸收和利用提供科學依據，并且為促進乳品蛋白質相互作用機制的研究提供參考。