熒光免疫層析法定量檢測CHI3L1的性能評價及其在肝纖維診斷中的應用

湖南省藥品審評認證與不良反應監測中心 （湖南 長沙 410013）

內容提要： 目的：對采用熒光免疫層析法定量檢測CHI3L1的試劑盒進行性能評價，以及評估CHI3L1在輔助肝纖維診斷的臨床價值。方法：對廠家提供的CHI3L1試劑盒從空白檢測限、精密度、準確度、特異性以及與肝組織活檢結果的符合率等方面進行全面的方法學評價。結果：該試劑盒空白檢測限＜5ng/mL；批內CV＜8.7%，批間CV＜9.8%；回收率95%～105%；與PCⅢ、AFP之間沒有交叉反應，特異性好；肝纖維患者的血清CHI3L1的水平明顯高于健康組，這兩差異具有統計學意義（P＜0.05）；臨床符合率為84.7%。結論：CHI3L1熒光免疫層析法試劑盒能夠實現定量、靈敏、快速和準確檢測，滿足臨床檢測需求，在肝纖維的輔助診斷中具有一定的臨床價值。

肝纖維化是肝臟組織對各種病因引起的肝臟炎癥或損傷后自我修復過程中的代償反應，在損傷因子的持續作用下，細胞外基質合成速度大于降解能力，導致細胞外基質過度沉積，形成肝纖維化[1]。肝纖維化是各種慢性肝臟疾病的病理基礎，如不及時治療可能向肝硬化和肝癌方向發展，并出現各種終末期肝臟并發癥，嚴重威脅人類的生命健康[2]。研究表明，肝纖維化是形成與消退動態平衡的病理過程，肝纖維化可以通過干預消退逆轉，早期診斷肝纖維化并及時進行有效治療，有助于預防肝纖維化向肝硬化、肝癌等轉化的發生[3-5]。目前，肝組織活檢仍然是評估肝纖維化程度的金標準，然而其侵襲性、不便利性、取樣誤差以及存在并發癥風險等弊端限制了其在臨床上的應用[6]。因此，尋找反映肝臟損傷嚴重程度-尤其是肝纖維化程度的非侵入性診斷技術顯得尤為迫切[7,8]。近些年來，隨著體外診斷技術的發展，新型血清學標志物殼多糖酶3樣蛋白1（CHI3L1）在肝臟疾病中的診斷價值越來越引起研究人員的重視[9]。本研究旨在對采用熒光免疫層析法制備的殼多糖酶3樣蛋白1試紙條的性能進行評價，并進一步探討了CHI3L1在輔助肝纖維診斷的臨床價值。

1.資料與方法

1.1 臨床資料

以2019年1月～5月北京醫院院內確診的34例肝纖維患者作為研究對象，其中男性26例，女性8例，年齡32～65歲，其中酒精性患者12例、乙型肝炎患者14例、丙型肝炎患者8例。選取同期就診的25例健康體檢人員樣本作為健康對照組，所有患者排除其他系統性疾病。

儀器和試劑：殼多糖酶3樣蛋白1（CHI3L1）試劑盒（熒光免疫層析法）；配套對應的熒光免疫層析分析儀。

1.2 方法

1.2.1 實驗原理。將免疫層析技術與熒光微球標記技術相結合，采用雙抗體夾心法的原理，定量檢測血清中CHI3L1的濃度。將血液樣本滴加到試紙條的樣品墊上，在吸水墊的作用下，血液樣本向前層析，在標記物結合處血液樣本中的CHI3L1與熒光微球標記的一株鼠抗人CHI3L1單克隆抗體反應形成熒光微球標記的CHI3L1免疫復合物，熒光微球標記的兔IgG不參加反應，隨后沿著包被墊繼續層析，熒光微球標記的CHI3L1免疫復合物與檢測線包被的另一株鼠抗人CHI3L1單克隆抗體反應而停留在檢測線，熒光微球標記的兔IgG與質控線包被的羊抗兔多克隆抗體反應而停留在質控線，其他物質繼續層析，最后通過熒光免疫層析儀分別采集檢測線的熒光微球的信號（記作T）和質控線的熒光微球的信號（記作C），計算T/C值，從儀器內置的CHI3L1的標準曲線中直接讀取血液樣本中CHI3L1的濃度。

1.2.2 空白檢測限。隨機抽取三批次的零濃度校準品，分別平行檢測20次，計算測量值的平均值（M）和標準差（SD），計算測量值為M+2SD時的濃度即為空白檢測限。

1.2.3 精密度。隨機抽取兩批CHI3L1試劑盒，15、50、100ng/mL濃度點各平行測定20次，分別計算兩批次試紙條批內和批間變異系數（CV）。

1.2.4 準確度。抽取三個批次濃度為200ng/mL的CHI3L1校準品，分別加入到濃度接近于0的陰性血清樣本中，其中所加入的CHI3L1校準品與陰性血清樣本的體積比為1:9，重復測定10次，將理論值與測定值進行比較，計算回收率，回收率應在85%～115%?；厥章?實際濃度/理論濃度×100%。

1.2.5 特異性。分別取51μg/mL的Ⅲ型前膠原（PCⅢ）和600ng/mL的甲胎蛋白（AFP）分別用CHI3L1（熒光免疫層析法）進行檢測，15min后讀取檢測結果。

1.3 統計學分析

采用PSPP 20.0對搜集的材料進行統計學分析，計量資料以M±D表示，采用t檢驗，當P＜0.05時，差異具有統計學意義。

2.結果

2.1 空白檢測限

根據公式M+2SD計算，三個批次零濃度校準品的空白檢測限依次為2.09、4.49、3.47ng/mL（見表1），均＜5ng/mL，該試劑盒具有較高的靈敏度。

2.2 精密度

隨機抽取兩個批次的CHI3L1試劑盒，分別對CHI3L1濃度為15、50、100ng/mL的樣本進行測定，從表2中可以看出，批內變異系數＜8.7%，批間變異系數＜9.8%，說明該CHI3L1試劑盒（熒光免疫層析法）具有較高的精密度。

表1. 空白檢測限的測定

表2. 精密度分析

表3. 特異性分析

2.3 準確度

抽取的三批CHI3L1校準品的回收率分別為103.24%、95.12%、104.38%，測定結果符合標準，表明該CHI3L1試劑盒（熒光免疫層析法）具有較好的精密度。

2.4 特異性

CHI3L1試劑盒（熒光免疫層析法）特異性的檢測結果如表3所示，PCⅢ和AFP的測試結果均＜5ng/mL，表明該試劑盒與PⅢNP、AFP之間不存在交叉反應，抗體的特異性高。

2.5 統計學方法及臨床符合率

廠家給定的CHI3L1試劑盒（熒光免疫層析法）的線性范圍為5～200ng/mL，參考區間為＜79ng/mL。對兩組檢查人群的血清CHI3L1檢測結果比較：肝纖維患者CHI3L1濃度明顯高于健康組，P＜0.05，差異具有統計學意義（表4）。CHI3L1試劑盒（免疫層析法）與肝組織活檢驗的臨床符合率為84.7%（表5），K值為0.6126，表明兩種檢測結果具有一致性。

3.討論

殼多糖酶3樣蛋白1（Chitinase 3-like protein 1，CHI3L1），又名YKL-40，分子量為42.6kD，是哺乳動物幾丁質酶家族成員之一，可由軟骨細胞、巨噬細胞、腫瘤細胞、中性粒細胞以及滑膜細胞等分泌。研究發現，YKL-40是內皮細胞和成纖維細胞的生長因子，其血清濃度與由成纖維細胞和肝星狀細胞（Hepatic stellate cell，HSCs）所分泌的細胞外基質有關，在肝臟組織中高度表達，通過參與促進細胞外基質重塑和炎癥反應而參與到肝臟纖維化過程中[10]。Tran等[11]和N?jgaard等[12]研究發現YKL-40在酒精性肝病患者的血清中有較高水平，并可能提供預后信息。曹欣等[13]對慢性乙型肝炎感染者血清YKL-40進行檢測，研究發現血清YKL-40水平可以區分輕度與中重度肝纖維化。YKL-40在肝纖維化方面高靈敏度和特異性，可用于作為評估酒精性肝病，乙型肝炎和丙型肝炎等多種病因導致的肝纖維化的血清標志物[14-16]。目前市面上，YKL-40的試劑盒較少，主要為酶聯免疫法，隨著檢驗技術的發展，新型檢測手段成為一種內在需求。

表4. 兩組檢測人群檢測結果比較(ng/mL)

表5. 兩檢測人群檢測結果符合率比較(n)

本研究采用的CHI3L1試劑盒（熒光免疫層析法）的空白檢測限＜5ng/mL，回收率95%～105%，具有非常高的精密度。與PCⅢ、AFP之間沒有交叉反應，特異性好。通過檢測肝纖維患者與健康組的CHI3L1水平，兩組人群檢測結果差異具有統計學意義（P＜0.05）；臨床符合率為84.7%。該方法的成本低、操作簡單，能夠實現即使檢測，為臨床輔助診斷肝纖維提供一種便捷可靠的途徑。除此之外，從本研究中可以看出，CHI3L1試劑盒（熒光免疫層析法）與肝組織活檢中存在一定的差異，這可能是由于以下幾方面的原因產生的：①活檢的樣本太少，活檢的部位太淺，活檢的部位不是病理部位，醫生的經驗不足，判斷失誤；②試劑盒的準確性和特異性方面需要進一步完善等。實際臨床應用中，單項血清學指標在診斷肝纖維方面存在一定的局限性，為了更準確、更好地評價肝纖維化以及其進展程度，需要聯合其他血清學標志物進行檢測。