焦磷酸測序技術在豬繁殖與呼吸綜合征診斷檢測中的應用

曹丙蕾，張 群，劉 敏，王 群，尹偉力

（1.濟南海關技術中心，山東 濟南 250014；2.青島海關技術中心，山東 青島 264001）

豬繁殖與呼吸綜合征又稱藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的一種急性高度傳染性疾病，主要表現為母豬繁殖障礙和仔豬呼吸障礙[1-3]。研究發現，豬高熱病主要是由高致病性PRRSV 引起的，及時準確檢測PRRSV 是豬藍耳病診斷和防控的重要前提[2-4]。

焦磷酸測序技術是一種短鏈測序技術。該技術可以簡便即時高效地進行短DNA 序列分析，檢測通量高，可同時對多達96 個樣本進行測序，無需對DNA 片段進行電泳和熒光標記，有效保證了檢測結果的準確可靠[5]。本研究針對PRRSV 的N 蛋白基因序列，建立了一種可直接確定基因序列的焦磷酸測序技術。通過測序結果，直接在基因序列水平對PRRSV 進行鑒別診斷，避免存在假陽性結果，提高了陽性檢出率，在基因水平上準確鑒定PRRSV。

1 材料與方法

1.1 材料

PRRSV、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）等病毒樣本由本實驗室保存。M-MLV 反轉錄酶、PrimeScript One Step RT-PCR Kit、100bp DNA Ladder Marker 及相關試劑等購自Takara 公司；PyroMarkTM ID System、Vacuum Prep Tool、鏈霉親和素包被磁珠、PyroGold SQA Reagents 1×96 DNA 序列分析試劑盒及相關試劑均為Gene 公司產品。核酸提取儀及配套的核酸提取試劑盒由天根科技提供。

1.2 方法

1.2.1 焦磷酸測序引物的設計

從GenBank 上篩選出PRRSV N 蛋白基因（ORF7 基因）的保守序列，利用焦磷酸測序分析軟件設計一對擴增引物N-F和N-R 及測序引物N-S，見表1，引物N-R 5’端加入生物素標記，預期片段大小為239bp。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1 PRRSV的擴增引物及測序引物Tab.1 The amplification primers and sequencing primers of PRRSV

1.2.2 病毒核酸的提取

收集PRRSV、PEDV、TGEV 等病毒材料采用磁珠法核酸提取原理進行核酸提取，使用專用核酸提取試劑盒，按照說明書進行操作，提取的核酸立即使用或-70℃保存備用。

1.2.3 RT-PCR反應

按照一步法RT-PCR 試劑盒說明配置50 μL 反應體系，反應條件如下：50℃30 min；94℃2 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，35 個循環；72℃7 min，反應結束后取5 μL PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，一部分產物送往上海生工生物工程有限公司進行測序，其余擴增產物進入下一步焦磷酸測序。

1.2.4 焦磷酸測序反應

制備測序單鏈模板。依據儀器操作說明制備測序單鏈模板，將含有鏈霉親和素包被磁珠的結合緩沖液與PCR 產物振蕩混勻10min，用超純水沖洗vacuum prep tool 30 s，抓取結合PCR 產物的磁珠，再接著用70%乙醇洗滌5 s，Denatureation buffer 洗滌5 s，Washing buffer 中清洗10 s，將vacuum prep tool放入含有測序引物的PSQ 96孔板中，搖晃釋放磁珠，將反應板置于基因擴增儀上80℃恒溫2 min，自然冷卻。

測序反應。根據儀器設定的程序和試劑用量，將酶混合物（DNA 聚合酶、ATP 硫酸酯酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶）、底物APS 和dNTP 加入試劑艙對應孔位，將試劑艙和96 孔測序板移入儀器反應艙中，運行儀器程序，反應結束后系統出具測序結果，通過在線BLAST分析即可得知結果并比較其序列特異性。

1.2.5 特異性試驗

以PRRSV、TGEV、PEDV 和PRV 等核酸為模板進行RTPCR 擴增，按照上述1.2.4 進行焦磷酸測序檢測，結果直接顯示基因序列，通過BLAST分析確定反應特異性。并對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，鑒定引物的特異性。

1.2.6 靈敏度試驗

對PRRSV 核酸（60ng/μL）依次進行梯度稀釋后，各個稀釋度分別作為模板進行擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增條帶，并確定用于焦磷酸測序中RT-PCR 的最低檢測限，同時也對各個稀釋度的擴增產物進行焦磷酸測序。

1.2.7 重復性試驗

對同一份擴增產物進行3 次焦磷酸測序，對結果進行分析，同時，對同份核酸進行3 次擴增并進行焦磷酸測序，對結果進行分析，確定方法的重復性和穩定性。

1.2.8 在實際檢測中的應用

從20 個疑似PRRSV 的臨床樣本中提取核酸，經擴增后進行焦磷酸測序。同時將擴增產物送往上海生工生物工程有限公司進行測序。通過兩者結果比對，確定該焦磷酸測序技術的高效性和實用性。

2 結果

2.1 RT-PCR結果

PRRSV 核酸擴增片段大小為239 bp，與預期目的片段大小一致。測序結果表明目的條帶與PRRSV N 蛋白基因片段具有100%的同源性。

2.2 焦磷酸測序技術

焦磷酸測序儀出具的PRRSV 短序列為：CTAGCGACTGAAGATGATGTCAGAC ATCACTTTACCCC，焦磷酸測序結果與普通測序結果相比，符合率為100%，無序列差異，且該序列進行BLAST分析后發現，該序列結果屬于PRRSV N蛋白基因的特異性序列，以此為準可直接進行PRRSV 的確診，避免了假陽性結果的出現，且在35 min左右即可完成焦磷酸測序，與外送測序相比，大大提高了工作效率。

2.3 特異性試驗

特異性試驗結果表明，只有PRRSV獲得了焦磷酸測序的序列結果，通過BLAST 分析，該結果與目的片段符合率為100%，其他無關核酸樣品無序列結果顯示，擴增產物經電泳分析，只有PRRSV擴增出了目的片段，其余未見有條帶出現，所建立的焦磷酸測序技術具有較好的特異性。

2.4 靈敏度試驗

從RT-PCR 的結果分析來看，RT-PCR 擴增的最低核酸檢測限為0.1pg/test，由于要達到焦磷酸測序所要求的條件，故在焦磷酸測序中最低核酸檢測限為10 pg/test。

2.5 重復性結果

經多次重復性檢測，檢測結果均保持一致，所建立的焦磷酸測序技術具有較好的重復性和穩定性。

2.6 樣品檢測

經臨床樣本檢測，陽性15 例，陰性5 例，測序結果與焦磷酸鹽測序結果和普通測序結果一致，符合率為100%，且與普通測序相比，明顯提高了檢測效率和準確性。

3 討論

實驗室常用的動物疫病病原診斷方法有很多，包括病毒分離鑒定、RT-PCR 和熒光RT-PCR 等，這些都有一定的特異性和敏感性，在動物疫病的篩查診斷中發揮了很大的作用，但是無法立馬得知分子診斷的基因序列，會導致假陽性結果的出現，無法獲知準確結果，即便進行目的片段測序，也需要再采用Sanger 測序法進行，這無疑將檢測時限延長了，無法立即判定準確結果，耗時耗力。

焦磷酸測序是一種全新的短序列測序檢測技術，可通過短序列片段的基因序列即時判定結果，具有直觀、快速、靈敏等特點，且省去了Sanger 測序或外送測序公司測序確診的步驟，基因序列結果可直觀地通過焦磷酸測序展現出來，減少假陽性結果的出現，提高了動物疫病診斷效率，且焦磷酸測序檢測時限短，縮短了檢測時長，提高了確診工作效率，為動物疫病防控提供了高效的檢測手段。

目前，豬藍耳病仍是引起豬群重大動物流行病的主要疾病之一，有歐洲型和美洲型2 種基因型。PRRSV 有多個結構蛋白，其中以編碼核衣殼蛋白（N）的ORF 7基因最為保守，該蛋白是免疫原性最強的蛋白，能刺激機體產生強烈的免疫應答，因此，蛋白基因也是各個學者及研究機構研究PRRSV 的首選研究對象[2，4]。

本研究選用PRRSV N蛋白基因為研究對象，設計了焦磷酸測序技術的擴增引物及測序引物，經擴增后將產物直接進行焦磷酸測序，獲得一段特異性的基因序列，該短序列可作為PRRSV 鑒定的靶序列，直接從基因序列中確定PRRSV。鑒于焦磷酸測序可以直接獲取序列結果，下一步研究方向主要是利用這一技術特點來研究PRRSV的變異情況，直接從基因序列的突變、缺失、插入等情況來判定目前豬繁殖與呼吸綜合征的流行趨勢，便于更好地進行疫病監控與追蹤。