扁吻魚胚胎發育及仔稚魚形態與生長觀察研究

韓軍軍，賀疆滔，陳 朋，胡江偉，祁 峰，封永輝，蔡林鋼，時春明，張人銘

（新疆維吾爾自治區水產科學研究所/農業農村部西北地區漁業資源環境科學觀測實驗站，新疆 烏魯木齊 830000）

扁吻魚 (Aspiorhynchus laticeps) 俗稱新疆大頭魚，體長、頭大、吻扁、眼小，生長緩慢，隸屬于硬骨魚綱、鯉形目、鯉科、扁吻魚屬。扁吻魚1 屬1 種，是我國塔里木河水系特有的肉食魚類，主要以塔里木裂腹魚 (Schizothorax biddulphi)、草魚 (Ctenopharyngodon idella)、鯉 (Cyprinus carpio)等為食[1]。由于過度捕撈和環境破壞，野生扁吻魚數量急劇減少，1998 年被列為國家Ⅰ類保護水生野生動物，被稱為“水中大熊貓”和“古魚類活化石”，具有很高的經濟價值和科研價值[2]。根據馬燕武等[3]的調查研究，扁吻魚野生資源急劇減少，棲息地和產卵場的破壞使野生種群難以得到補充。因此，開展扁吻魚的人工繁育必不可少，通過人工孵化技術可以顯著提高魚類的繁殖能力，并取得巨大的經濟和生態效益[4]。在開展人工繁育時，魚類早期生活史研究是魚類自然資源繁殖保護和養殖業苗種培育的基礎[5]，本研究在人工培育條件下觀察扁吻魚胚胎發育過程、仔稚魚形態變化與生長特性，旨在了解其早期生長和發育情況，為今后苗種培育奠定理論基礎，在實現扁吻魚野生資源恢復及提供技術支撐方面，具有重要的實際意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料選用新疆水生野生動物救護中心全人工養殖的子一代扁吻魚作為繁殖親本。親本養殖在圓形PE 桶內 (直徑2.2 m，高0.8 m)，每天09:00、13:00、17:00 各投喂1 次，PE 桶每隔15 d 清洗并換水1 次。根據親本的性成熟程度選取成熟度好的魚體用于繁殖，其中雌魚9 尾，質量 (4.22±0.37) kg，雄魚6 尾，質量 (2.12±0.13) kg，雌雄配比為3∶2。扁吻魚繁殖期為四月中旬，水溫 (16.27±0.41) ℃，pH 7.3±0.23，溶解氧質量濃度為 (9.85±0.43) mg·L?1。

1.2 人工催產和孵化

扁吻魚孵化采用人工催產，催產藥物是促黃體生成素釋放激素類似物 (LRH-A2，0.125 mg，寧波第二激素廠) 和馬來酸地歐酮 (DOM，100 mg，寧波三生生物科技有限公司)，雌魚每千克注射LRHA22 μg，DOM 2 mg，雄魚劑量減半，間隔24 h 注射1 次，雌魚注射3 次，雄魚注射1 次。采用人工干法受精，首先將魚體用2-苯氧乙醇 (2-phenoxyethanol，2.5 kg，德國巴斯夫) 進行麻醉，撈出后魚體表面用吸水紙擦干，用毛巾固定魚體，輕輕拍打魚腹，手從前向后擠壓。將卵和精液先后擠入干燥塑料盆內，用羽毛順時針混勻后加入少量清水攪拌3 min，使魚卵充分受精。隨后用清水漂洗3 次，去除卵表面黏性和雜質。脫黏完成后加入清水并靜置30 min，使受精卵充分吸水膨脹，隨后將受精卵轉至孵化框 (100 cm×60 cm) 上，孵化框放置于孵化槽中部 (420 cm×80 cm×49 cm)，每個孵化槽放置3 塊孵化框，每個孵化框對角線兩端放入氣石，通過調節出氣量大小保證受精卵供氧充足，隔天將死卵用吸管吸出。

1.3 受精卵和仔魚的觀察與培育

受精成功后，隨機選取90 粒受精卵用于顯微觀察。受精卵各個時期的形態特征和仔魚發育的形態變化通過SDPTOP 顯微鏡進行觀察和拍照。扁吻魚受精卵發育初2 h 內，連續觀察，隨后每2 h觀察1 次。胚胎發育階段的劃分以50%以上樣本進入該階段來確定[6]。仔魚孵出后，每4 h 觀察1 次，觀察仔魚的不同發育階段特征，仔魚發育階段的劃分參照龔小玲等[7]。測量卵和仔稚魚的長度，計算受精率和孵化率。仔魚上浮可攝食后，投喂鹵蟲無節幼體，投喂時間09:00 和17:00。以臺微尺為參照物配合圖像處理軟件 (Adobe Photoshop CC 2015)對受精卵的卵徑和仔魚全長等進行測量。

1.4 數據分析

胚胎發育過程的有效積溫推算[6]：

其中K為有效積溫，N為發育所需時間，T為該發育階段的平均水溫。

卵黃囊體積 (V) 計算公式[6]：

其中L為卵黃囊長徑，D為短徑。

特定生長率 (Specific growth rate,SGR) 計算公式[8]：

其中t1、t2為日齡，LT1、LT2分別為t1、t2時的全長。

采用Excel 2007 和Adobe Photoshop CC 2015 整理實驗數據并統計作圖。SPSS Statistics 23.0 軟件對各組數據進行單因素方差分析 (Oneway ANOVA)，差異顯著水平設置為P<0.05，數據以“平均值±標準差 ()”表示。

2 結果

2.1 受精卵的發育

扁吻魚成熟卵呈橢圓球形，青灰色不透明，微黏，沉性卵。成熟卵卵徑 (2.46±0.13) mm。受精吸水后迅速膨脹，吸水后卵徑了 (3.42±0.15) mm，較吸水前增大了39.02%。吸水后受精卵和未受精卵顏色變淡，卵周隙增大。受精成功的卵細胞開始胚胎發育，部分未受精的成熟卵在吸水膨脹后會卵裂，但多數發育至多細胞期死亡，少數可發育至囊胚期。

圖1 扁吻魚胚胎發育a.成熟卵；b.受精卵；c.1 細胞期；d.2 細胞期；e.4 細胞期；f.8 細胞期；g.16 細胞期；h.桑葚期；i.囊胚早期；j.囊胚中期；k.囊胚晚期；l.原腸早期；m.原腸中期；n.原腸晚期；o.神經胚期；p.胚孔閉合期；q.視囊出現期；r.肌肉效應期；s.耳石形成期；t.孵化前期Figure 1 Embryonic development of A.laticepsa.Mature egg;b.Fertilized egg;c.1-cell stage;d.2-cell stage;e.4-cell stage;f.8-cell stage;g.16-cell stage;h.Morula stage;i.Early blastula stage;j.Middle blastula stage;k.Late blastula stage;l.Early gastrula stage;m.Mid-gastrula stage;n.Late gastrula stage;o.Neurula stage;p.Blastopore closed stage;q.Optic capsule stage;r.Muscular effect stage;s.Otolith formation stage;t.Prehatching stage

受精卵吸水膨脹后，卵黃收縮下沉到卵內下部，原生質向動物極移動，隆起形成胚盤 (圖1-a～c)。卵裂階段發展迅速，形成后35 min，胚盤表面形成分裂溝，胚盤分裂成2 個大小相等的分裂球(圖1-d)。受精110 min 后開始第二次分裂，分裂方向與第一次分裂垂直，進入4 細胞期 (圖1-e)。第三次分裂形成2 條分裂溝，與第一次分裂平行，形成8 個大小基本相等的分裂球 (圖1-f)。受精卵分裂形成16 個分裂球后分裂球越分越小 (圖1-g)，個體差異變大且分裂細胞開始不規則排列，但細胞界限仍然可見 (圖1-h)。細胞界限模糊后形成高囊胚，進入囊胚早期 (圖1-i)。囊胚中期時囊胚高度下降，胚層變薄，直至形成胚環 (圖1-j～k)。原腸期可分為原腸早期、原腸中期和原腸晚期。從原腸早期囊胚細胞開始下包，到原腸晚期時胚層下包4/5 (圖1-l～n)。原腸晚期后胚盤頂部逐漸隆起腫大，腦泡開始形成，神經板和卵黃栓出現 (圖1-o～p)。胚孔封閉后胚體出現肌節，在腦兩側出現與體軸平行的長圓形泡，即眼的原基 (圖1-q)。頭部進一步分化，胚體出現不規律收縮，肌節增加，尾部末端尾鰭褶出現，胚體開始在膜內扭動，平均(20.42±2.84)次·min?1，兩側聽囊內出現一對透明的圓點，即耳石 (圖1-r～s)。受精44.33 h 后胚體尾尖已彎至眼部，心臟開始搏動，胚體在膜內不停扭動，直至出膜 (圖1-t)。根據胚胎發育的外部形態和典型特征將其分為受精卵、胚盤形成、卵裂、囊胚、原腸、神經胚、器官分化和孵化共8 個階段，整個胚胎發育耗時115.72 h，所需積溫為3 765.42 ℃·h，其中器官形成階段耗時最長 (47.67 h)，積溫775.54 ℃·h。各發育階段耗時和積溫詳見表1。

表1 扁吻魚胚胎發育時序Table 1 Process of embryonic development of A.laticeps

2.2 仔稚魚的發育

根據扁吻魚仔稚魚的外部形態變化和器官形成，將仔稚魚分為仔魚前期、仔魚后期和稚魚期3 個階段。初孵仔魚卵黃囊前部呈橢圓形，后部為長棒狀，體積為 (6.10±0.19) mm3。卵黃在仔魚孵化后9 d 內消耗完畢，其中前3 d 吸收最快，3 d 內卵黃消耗75.57%，隨后趨于平緩。仔魚在出膜后第7 天開始攝食，進入混合營養期。扁吻魚仔魚卵黃囊的平均體積與孵化后的天數關系見圖2。

圖2 扁吻魚仔魚卵黃囊體積與出膜天數的關系Figure 2 Relationship between yolk sac volume and days of hatching of A.laticeps

初孵仔魚全長 (7.58±0.31) mm，通體透明，脊索略彎曲，心臟位于卵黃囊前方，可觀察到明顯心跳，有無色血液流動，眼無黑色素沉積，初孵仔魚一般側臥水體，可通過魚尾擺動平游 (圖3-a)。2 d 后仔魚全長 (8.53±0.36) mm，卵黃囊被進一步吸收，晶體顏色加深，血液顏色加深，心跳頻率(53.60±5.00) 次·min?1，能明顯觀察到紅色血液流動軌跡，仔魚的頭部出現星狀色素，口能活動 (圖3-b)。5 d 后仔魚全長 (9.34±0.23) mm，胸鰭出現，星狀色素已經遍布魚體，眼球色素明顯增多。7 d 后腸道內可見明顯食物殘留，體色加深，尾椎骨上翹明顯，仔魚全長 (9.72±0.14) mm。卵黃在9 d 后吸收完畢，魚鰾清晰可見，鰓蓋可見節律性地張開，仔魚全長 (10.50±0.21) mm (圖3-c)。仔魚前期全長特定生長率為 (3.63±0.68)%，前期仔魚在前3 d 魚體全長增長較快，第4 天到第7 天較為平緩，隨后增大 (圖4)。前7 d 變化趨勢與卵黃囊消耗速率一致，7 d 后速度增大是由于仔魚開始開口攝食。

圖3 扁吻魚仔稚魚發育a.初孵仔魚；b.出膜2 d；c.出膜9 d；d.出膜26 d；e.出膜45 d；f.出膜86 d；g.1 齡幼魚；h.2 齡幼魚Figure 3 Delopment of A.laticeps larva and juvenilea.Newly hatched larva;b.2 d post hatching;c.9 d post hatching;d.26 d post hatching;e.45 d post hatching;f.86 d post hatching;g.yearling;h.Two-year-old of young fish

圖4 扁吻魚前期仔魚全長Figure 4 Total length of A.laticeps prelarva

仔魚后期，卵黃已被完全吸收，仔魚進入外源性營養階段，整個仔魚后期歷時36 d。仔魚在出膜26 d 后全長 (19.86±0.55) mm，頭部色素斑塊密集，鰓蓋不透明，各鰭條上出現色斑，尾鰭未分叉(圖3-d)。45 d 時各鰭條已發育完全，魚體整體呈黃色，背部遍布色素斑點，側線明顯，魚體全長(37.10±0.45) mm (圖3-e)。仔魚后期全長特定生長率為 (3.51±2.10)%。

稚魚鱗片首先出現側線鱗，隨后在鰓蓋后緣側線上下、背鰭基部發現鱗片，以鰓蓋后緣和背鰭基部為中心向四周延伸和覆蓋。出膜第86 天時稚魚全長 (79.67±0.48) mm，體質量 (3.56±0.28) g，此時側線鱗上方鱗片覆蓋完成，側線鱗下方尾柄基部鱗片覆蓋基本完成 (圖3-f)。整個稚魚期歷時63 d，全長特定生長率為 (1.32±0.17)%，魚類體型接近成魚，但體色和身體斑紋與成魚存在差異。仔魚后期、稚魚期魚體全長變化見圖5，稚魚期末時魚體全長是初孵仔魚的11.26 倍。

圖5 后期仔魚、稚魚全長Figure 5 Total length of A.laticeps postlarva and juvenile

2.3 扁吻魚人工催產時間、孵化和培育效果

本研究共采卵21.45×104粒，受精率88.95%，孵化率93.27%，采卵后親魚未出現死亡，孵化出的魚苗身體健康，游動活潑，轉入池塘后經過1 年培育，幼魚魚體平均全長 (15.71±0.89) cm，體質量(28.29±6.15) g，體型和體色與成魚接近 (圖3-g)。2 齡幼魚 (5.83±3.58) cm，體質量 (132.15±50.80) g，幼魚生長正常，體型和體色已與成魚無異 (圖3-h)。

3 討論

3.1 扁吻魚與其他裂腹魚類卵細胞顏色差異分析

扁吻魚卵細胞呈青灰色，與經過人工養殖的塔里木裂腹魚卵色一致[9]，齊口裂腹魚(Sclizothorax prenanti)[10]、斑重唇魚 (Diptychus maculates)[11]、光唇裂腹魚 (S.lissolabiatus)[12]和拉薩裸裂尻魚(Schizopygopsis younghusbandi)[13]的卵呈金黃色，短須裂腹魚 (S.wangchiachii)[14]、長絲裂腹魚 (S.dolichonema)[15]、小裂腹魚 (S.parvus)[16]、雙須葉須魚 (Ptychobarbus dipogon)[17]和異齒裂腹魚 (S.o'connori)[18]的卵為淡黃色，尖裸鯉 (Oxygymnocypris stewartii) 的卵為黃色，拉薩裂腹魚(S.waltoni)的卵為棕色[13](表2)。綜上，不同裂腹魚的卵色存在差異，而且不同環境下同種裂腹魚類的卵色也會發生變化。謝春剛等[9]在對塔里木裂腹魚進行繁殖時發現兩個不同地區親本產的卵顏色不同，任波等[19]在2005 年對克孜爾水庫野生扁吻魚進行觀察時發現魚卵為淡黃色，2006 年捕獲野生親本產卵顏色為淺灰色[20]。張人銘等[21]觀察卵顏色是青灰色，與本研究一致。以往研究采用的扁吻魚野生親本均捕獲自渭干河，任波等捕獲野生扁吻魚后直接進行觀察和研究，張人銘等則是將親魚轉運至阿克蘇養殖在池塘中馴化成熟后進行人工催產，魚類的生存環境、食物組成發生變化，進而導致卵的顏色發生變化。任波等2005、2006 年在克孜爾水庫的捕獲的野生扁吻魚卵的顏色也存在差異[19-20]，這表明扁吻魚的卵色變化不僅受生存環境和食物的影響，還可能存在造成其卵色差異的其他因素。

表2 其他裂腹魚類發育特點比較Table 2 Comparison of developmental characteristics between other Schizothoracinaes

3.2 扁吻魚胚胎、仔稚魚發育特征

扁吻魚孵化水溫 (16.27±0.41) ℃，高于斑重唇魚和長絲裂腹魚，與塔里木裂腹魚、齊口裂腹魚、光唇裂腹魚、短須裂腹魚等相近。扁吻魚成熟卵卵徑 (2.46±0.13) mm，大于塔里木裂腹魚、光唇裂腹魚和小裂腹魚，小于齊口裂腹魚、短須裂腹魚和長絲裂腹魚，與重口裂腹魚 (S.davidi)[22]、尖裸鯉、拉薩裸裂尻魚和異齒裂腹魚相近 (表2)。吸水后受精卵迅速膨脹，卵徑 (3.42±0.15) mm，較吸水前增大了39.02%，低于塔里木裂腹魚 (58.82%)、長絲裂腹魚 (44.2%)、光唇裂腹魚 (45.45%)、小裂腹魚(57.89%)和異齒裂腹魚 (52.91%)，與齊口裂腹魚(40%) 和拉薩裂腹魚 (36.61%) 相近，高于短須裂腹魚 (27.40%)、尖裸鯉 (25.29%) 和拉薩裸裂尻魚(25.29%)。而且在以往研究中，獲取的扁吻魚受精卵卵徑介于1.5～1.85 mm[20-21]，小于本研究。魚類卵徑大小因物種不同存在差異，同種間因親魚不同、環境變化及產卵時間不同，卵細胞大小也有差異[23-24]。本研究采用的扁吻魚親魚為全人工繁殖的子一代，養殖地點在昌吉，而之前研究則是選取渭干河流域 (阿克蘇地區) 的野生扁吻魚作為親本，推測環境變化和親本差異是扁吻魚卵徑變化的主要原因。裂腹魚類一般為沉性卵，受精卵吸水膨脹后體積擴大，密度減小，在靜水中卵沉在水底，有一定水流時可隨流漂浮流動，從而提高受精卵成活率，保證幼魚發育[25]。

扁吻魚初孵仔魚長度 (7.91±0.31) mm，大于斑重唇魚，小于短須裂腹魚、長絲裂腹魚和重口裂腹魚，與塔里木裂腹魚和光唇裂腹魚相近。仔魚在開口攝食前發育所需營養物質由卵黃提供[26]。不同裂腹魚類卵黃吸收時間存在差異，如塔里木裂腹魚卵黃吸收時間為8 d，重口裂腹魚為17 d，拉薩裂腹魚為23 d[27]，短須裂腹魚和扁吻魚為9 d。扁吻魚仔魚前期存在混合營養期，時間為2 d，短于重口裂腹魚的4 d、短須裂腹魚的3 d?；旌蠣I養期是仔魚從內源性營養向外源性營養的過渡階段，是魚類早期發育的一個重要階段[28]。重口裂腹魚繁殖月份為8—9 月，短須裂腹魚的為2 月，此時水體中浮游動物豐度低，仔魚需要較長的混合營養期來適應餌料生物匱乏的不利環境[28-29]。扁吻魚繁殖月份為4 月中下旬，此時水溫逐漸升高，水中餌料生物較為豐富，可滿足其仔魚的攝食需求。

3.3 扁吻魚仔稚魚生長速率

仔魚前期歷時9 d，其中前3 d 生長速度快，3 d 內卵黃消耗75.57%，說明在仔魚初孵時期卵黃作為營養物質主要用于仔魚身體的快速生長，第4 至第7 天仔魚生長速度降低，卵黃消耗低，營養主要用于消化系統等器官的生長，第7 天后仔魚開始攝食，進入混合營養階段，生長速度加快，仔魚前期全長特定生長率為 (3.63±0.68)%。仔魚后期歷時36 d，全長特定生長率為 (3.51±2.10)%。稚魚期歷時63 d，全長特定生長率為 (1.32±0.17)%。仔魚前期和仔魚后期全長特定生長率無顯著差異 (P>0.05)，稚魚期顯著低于仔魚前期、仔魚后期 (P<0.05)，這與華鳊 (Sinibrama taeniatus)[8]、短須裂腹魚[30]仔稚魚全長特定生長率變化趨勢基本一致。