棘皮動物神經肽的研究進展?

陳慕雁，鄭穎秋，叢 瀟

(海水養殖教育部重點實驗室(中國海洋大學), 山東 青島 266003)

1 神經肽介紹

神經肽作為一種化學信號，廣泛參與、調節動物的生理過程和行為。相較于其他調節因子，神經肽的研究起步較晚，建立在20世紀生理學、內分泌學和生物化學領域的開創性研究基礎之上，并基于三個開創性概念：(1)肽激素是內分泌系統中的化學信號；(2)肽激素的神經分泌遵循神經系統運作的一般原理；(3)神經系統對肽信號能做出反應[1]。1971年，De Wied提出了“神經肽”一詞來描述神經活性肽激素及其片段[2]。1975年，腦啡肽的鑒定開創性地將激素從內分泌學領域帶入到神經科學領域[3]。隨著放射性配體結合測定法和分子技術的發展，受體的鑒定使得神經肽的作用方式得以明確，神經肽的定義也越來越明晰，即“神經肽是由神經元合成分泌并釋放作用于神經底物的小蛋白質物質?！贝撕笊窠涬牡难芯窟M入新階段[1]。

作為一種內源性肽段，神經肽在生物體內可作為神經遞質，神經調質或神經激素，進行細胞間信號傳導，是神經系統最大、最多樣化的一類信號分子。神經肽長度不等，通常具有3～100個氨基酸[4]，例如，促甲狀腺激素釋放激素(TRH)僅具有3個氨基酸殘基[5]，促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)具有41個氨基酸殘基[6]。神經肽都具有一些共同的特征：(1)衍生自較大的前體蛋白；(2)具有靶向調節前體蛋白分泌途徑的N-末端信號肽；(3)前體蛋白具有典型的切割位點(例如，由激素原轉化酶識別的一元或二元位點)；(4)具有對生物活性至關重要的翻譯后修飾的位點(例如，C-末端甘氨酸殘基常常是酰胺化的底物，其對于成熟蛋白質的活性至關重要)；(5)除少數例外，神經肽通常結合并激活屬于視紫紅質-β，視紫紅質-γ和胰泌素secretin型受體家族的G-蛋白偶聯受體(GPCR)來發揮作用[1]。上述特征是發掘神經肽在生物生命活動中的功能的基礎，而功能探究一直是神經肽研究的重點。

1.1 神經肽的功能特征

人和動物的生理活動主要具有三大調節手段，即神經調節、體液調節和自身調節。相較于體液調節緩慢持久的特點，神經調節過程更為短暫精準。在神經調節過程中，大量的神經遞質(例如，乙酰膽堿、5-羥色胺(5-HT)等)作為信息傳遞的“信使”，參與各項生命活動。神經肽通常與氨基酸和生物原胺類神經遞質共存于神經末梢，按需存儲和調節釋放，但只有在強烈或長期刺激后才能釋放[7]。因此，與“快速神經遞質”相比，例如興奮性氨基酸和生物原胺類物質，神經肽的細胞響應過程通常相對緩慢持久，這種延遲一方面是由于其儲存在密集核囊泡中，這些囊泡未處于細胞釋放位點(突觸或突觸按鈕)，需要募集后再進行釋放。此外，對釋放的神經肽響應較慢的另一個原因是幾乎所有神經肽都作用于G蛋白偶聯受體(GPCR)。這些受體觸發分子內酶促事件的細胞內級聯反應，從而產生細胞反應。發生這種反應的時間跨度(秒或更長)比神經遞質的時間跨度要長得多，神經遞質直接作用于離子通道來調節離子通量(毫秒)[1]。

神經肽衍生自較大的前體蛋白。源自同一神經肽前體的不同神經肽生理活性可能相同，不同甚至相反。因此，鑒定源自同一個前體產生的所有肽的具體生物功能非常重要。神經肽在同一物種中可能扮演不同的角色。例如，在紅海盤車(Asteriasrubens)中，促甲狀腺激素釋放激素(TRH)型神經肽不僅介導幼蟲的變態附著，而且還可能參與信號傳導和加工的神經機制[8]。同時，同一種神經肽在不同物種中也可能具有相同的功能，例如軟體動物加利福尼亞海兔(Aplysiacalifornica)、甲殼動物小龍蝦(Orconectuslimosus)及紅海盤車中的Pedal peptide(PP)/orcokinin(OK)型神經肽(刺激肌肉)[9-11]，軟體動物靜水椎實螺(Lymnaeastagnalis)、線形動物秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)及紅海盤車中的加壓素/催產素型(VP / OT)神經肽(繁殖)[12-14]以及紅海盤車和海參(Holothuriaglaberrima、Apostichopusjaponicus)中的SALMF型(肌肉松弛劑)[15-17]等。

1.2 神經肽的作用方式

神經肽受神經元控制，直接通過神經受體調節介導神經功能[1]。它們可以直接作為神經遞質、神經調質，也可以作為封閉的細胞環境中的自分泌或旁分泌調節劑，或者長距離的激素。通常，神經肽信號系統通過激活相應的GPCR調節生物學功能和行為。神經肽作用于受體的方式有兩種，一種是直接與位于突觸后神經元的受體結合，通過調節離子通道活性，直接影響突觸后神經元的興奮性；另一種是通過激活位于突觸前軸突末端的受體，影響小分子神經遞質的釋放，間接影響突觸后神經元的興奮性[18]。關于G蛋白偶聯受體，不同的G蛋白亞基(Gα，Gβ，Gγ)具有不同的功能。通常，神經肽與受體結合后，GPCR被激活，亞基發生構象變化，導致Gα和Gβγ亞基功能解離，從而調節下游效應子，例如磷脂酶，AC或離子通道[19]。這些在細胞水平的作用將分別在器官系統或個體水平表現為生理活動或行為的變化。

2 棘皮動物神經肽功能研究的意義

神經肽是大腦和其他周圍器官中高度多樣化的信號分子，以特定的方式影響大腦和機體活動，廣泛參與調節動物生理過程和行為。例如，對溫度波動等外部環境因子的響應[20]，對攝食、代謝、運動、繁殖等生理過程的調節等[21-23]。因此，了解特定神經肽如何響應環境波動以及參與動物生理功能的調節，探明神經肽與受體之間如何相互作用有助于在細胞和個體水平更好地理解其潛在的調控機制。

棘皮動物屬于后口無脊椎動物，全世界化石種類接近13 000種[24]，現存有5個綱：海膽綱、海參綱、海星綱、蛇尾綱和海百合綱，分布范圍廣泛，多營底棲生活，在海洋生態系統的結構和功能中發揮重要作用[25]。在兩側對稱動物中，棘皮動物連接起原口動物與脊索動物之間進化的“橋梁”，相較于原口動物，與脊索動物親緣關系更近，因此，棘皮動物神經肽的功能研究將為高等動物提供更多的參考。此外，棘皮動物具有獨特的生物學特征及特殊生理現象。例如，成體的五輻對稱、分散的神經系統、特殊的水管系統輔助攝食、運動和其他功能[26]。有研究表明，神經肽可能參與介導棘皮動物中幾種特殊生物學現象的神經控制，包括自溶、再生[27]及其膠原組織的可變性[28-29]，這些對于我們進一步查明棘皮動物特殊生理行為分子調控機制具有重要意義。

隨著基因組、轉錄組及蛋白組學等測序技術的發展，棘皮動物中越來越多的神經肽得以鑒定。自2006年紫海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)基因組的測序以來[26]，目前已在棘皮動物4個綱的11個物種中獲得基因組序列數據，包括海膽綱(S.purpuratus,Lytechinusvariegatus,Eucidaristribuloides)、海參綱(A.japonicus,Apostichopusparvimensis,Parastichopusparvimensis,Australostichopusmollis)、海星綱(Acanthasterplanci,Patiriaminiata,Patiriellaregularis)和海蛇尾綱(Ophiothrixspiculata,Ophionereisfasciata)，而在海百合綱中尚未有相關報道[30-34]。同時，基因組、轉錄組及多肽組的多組學聯合分析，使得來自不同家族的神經肽前體及神經肽在棘皮動物某些代表性物種中得以鑒定(見表1)，為探明神經肽信號系統如何調節動物生理和行為過程奠定了基礎。棘皮動物神經肽的功能研究不僅有利于闡明其生理機制，也將為高效綠色養殖提供科學的理論支撐。

3 棘皮動物神經肽研究方法進展

大多數棘皮動物(海百合綱除外)的神經系統呈彌散狀，一般包含兩個部分，即外神經系統和深層神經系統[44]。由于其神經系統結構的獨特性及難以定位，使得其中央神經系統研究遠遠落后于其他動物，同時神經肽的高分子量，低體內濃度，高度結構多樣性和大量同工型，使得棘皮動物神經肽研究存在挑戰。困難和方法共存，隨著組學技術和分子生物學技術的發展，棘皮動物神經肽研究方法取得了很大進展，主要應用于神經肽的結構鑒定，時空分布特征及其生理功能探究。

表1 棘皮動物不同物種中已鑒定的神經肽及其前體數目

3.1 結構鑒定研究方法

神經肽結構鑒定是神經肽研究的基礎，包括氨基酸序列、翻譯后修飾(PTM)、折疊模式、結合位點等，這些信息有助于進一步闡明其功能和生物學機制。目前，質譜法(Mass spectrum, MS)是肽測序和確定神經肽PTM的普遍方法，隨著組學的發展，質譜法對低濃度肽檢測的靈敏度不斷提高，這使得“神經肽組”的鑒定成為可能，同時質譜法也存在一些缺陷，例如片段讀長一般為7～23個氨基酸，對于低于7個氨基酸的多肽尚無法檢測[45]。

根據不同的肽段或組織特性，序列結構測定方法也隨之調整。質譜在鑒定神經肽序列結構時通常與其他手段聯用。例如，基質輔助激光解吸電離質譜(MatriX assisted laser desorption ionization mass spectrometry, MALDI-MS)、電噴霧二級質譜(Electrospray ionization ion trap mass spectrometry, ESI-MS/MS)、超高效液相色譜-串聯質譜(Ultra performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)等分別成功地在佛羅里達弓背蟻(Camponotusfloridanus)、瓢蟲科(Coccinellidae)和葬甲科(Silphidae)部分甲蟲及多棘龍蝦(Panulirusinterruptus)的神經肽鑒定中得到應用[46-49]。其中，和ESI相比，MALDI對有較大分子量、更強疏水性和更低等電點的肽的檢測能力更強，傳輸效率較高，但ESI離子化效率更高。液相色譜(LC)與氣相色譜(GC)相比，氣相色譜具有分離效率和檢測靈敏度都更高的特點，而液相色譜分析范圍廣，對于難分離混合物的分析具有很高的準確性，串聯質譜則可以更好地分離分析樣品。相較于一級質譜，二級質譜能夠得到部分短肽的序列，具有更高的可靠性，且價格差距越來越小，是蛋白鑒定的大趨勢[50]。作為一種互補分離技術，離子遷移譜(Ion mobility spectroscopy, IMS)技術發展迅速，與MS結合使用后對肽結構的研究更加全面[51]。在進行神經肽鑒定時，可以參考親緣關系最近的模式生物或自身物種已有數據庫進行比對，此外，還可以利用de-novo測序等方法發掘新的神經肽[52]。近年來，已有研究者利用UPLC-MS/MS、nano LC-ESI-MS/MS等技術在棘皮動物的紫海膽、紅海盤車、棘冠海星、刺參和黑海參(Holothurialeucospilota)等物種中成功鑒定PP/OK、VP/OT、NPS/CCAP/NG等多個神經肽家族成員[23, 36-37, 40, 42, 53-54]。

富含二硫鍵神經肽的鑒定一直是神經肽鑒定的一大難題，核磁共振作為表征肽的構象和折疊模式的關鍵技術，可通過和質譜聯用快速鑒定微量肽樣品和表征二硫鍵[55]。結構特征對于神經肽與其受體之間的相互作用十分重要，通過核磁共振技術可以確定神經肽與受體位點的關系，評估與神經肽受體結合的激動劑和拮抗劑結構，從而確定其構象[56- 57]。在棘皮動物中，通過核磁共振與質譜聯用，成功在紅海盤車中鑒定到富含二硫鍵的VP/OT型神經肽[23]。

光譜是表征神經肽結構的另一手段。紅外(Infrared Spectroscopy, IR)光譜已成功用于二級結構元素的定量估算，包括α-螺旋，β-折疊和轉角[58]。 圓二色光譜(Circular Dichroism, CD)可用于二級結構的快速測定[59]。X射線晶體可表征神經肽與其受體在空間的結合特征，目前已在神經肽S和人OX2受體晶體結構的研究中得到應用[60]。

3.2 神經肽及其前體定位特征研究方法

組織中的神經肽定位可用于功能預測，為進一步功能鑒定提供基礎。神經肽及其前體的定位分析通常包括兩個層面：mRNA水平和蛋白水平。

在mRNA水平，主要通過原位雜交技術(In situ hybridization, ISH)，合成靶神經肽的探針，基于堿基互補配對原則，實現對神經肽前體的組織定位，而對于胚胎細胞、棘皮動物早期幼體等，一般采用整胚原位雜交(Whole mount in situ hybridization)。此外，通過熒光原位雜交技術(Fluorescence in situ hybridization，FISH)可以實現同時對多個物種中的多靶RNA進行高靈敏度檢測[61]。探針的標記方法包括放射性和非放射性兩種，普遍采用的標記方法是地高辛標記，具有靈敏度高、特異性強、檢測方便等優點，目前該方法已經廣泛應用于棘皮動物的神經肽前體mRNA定位[8, 62-63]。然而，在檢測低水平或單拷貝轉錄本時，豐度過低可能會造成假陰性，且RNA極易降解，對于神經肽前體的鑒定也造成了一定的困難。在某些模式生物中，例如黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)和秀麗隱桿線蟲，由于繁殖速度快，較易實現轉基因，可以建立啟動子報告基因代替ISH在mRNA水平進行定位，檢測更加便捷[64-66]，但目前此法尚未應用于棘皮動物。

神經肽的蛋白定位，主要利用抗原抗體結合的原理，在合成靶神經肽的抗體后，通過應用放射免疫測定(Radioimmunoassay, RIA)、免疫組織化學(Immunohistochemistry, IHC)、免疫細胞化學(Immunocytochemistry, ICC)、免疫熒光(Immunofluorescence, IF)和免疫電子顯微鏡技術實現細胞、組織和整個生物體水平神經肽的可視化。與傳統組織學方法相比，這些技術通過抗體的使用提高了反應的特異性和敏感性。然而，由于許多無脊椎動物神經肽基因編碼一種以上的生物活性肽，彼此之間具有很高的結構相似性，容易導致抗體交叉反應，產生假陽性，而N端定向抗血清可以輕松區分具有高度相似C端基序的肽，幫助克服交叉反應問題[67]。

隨著檢測技術的發展，ISH與ICC/IHC聯合使用，可以實現對靶神經肽及其前體的共同定位。同時通過合成多個靶探針，或者多個靶神經肽的抗體，利用不同的顯色標記，實現多個靶神經肽及其前體的同時檢測[67]。例如，利用雙重IF染色實現了對紅海盤車VP/OT型神經肽及其受體的共定位[23]；通過多重ISH，并結合IHC，可比較分析紫海膽長腕幼蟲階段9個神經肽及其前體的表達模式[62]。

3.3 神經肽及其前體定量分析技術研究

神經肽的定量通常是研究生理功能的第一步。在無法確定哪些神經肽參與生命活動調節時，通常通過改變外界因素(例如環境)，采集特定組織以定量比較，或者從動物中取出組織，在不同條件下孵育，觀察產生的影響。目前普遍采用免疫蛋白印跡法(Western blot)對單個蛋白質進行半定量分析。然而，由于神經肽通常分子量較小，難以檢測，因此此法通常用于評估神經肽相關蛋白，神經肽前體蛋白或神經肽受體的表達變化，例如海星Asterinapectinifera性腺刺激物質GSS相關的G蛋白(Gαs, Gαi, Gβ)的定量分析[68]。此外，還可以通過酶聯免疫吸附測定(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法來進行定量分析，但是檢測結果易受其他因素干擾，準確性較低。MS同樣可以應用于整體神經肽的定量表達模式分析，例如鹽度或溫度變化對甲殼動物北黃道蟹(Cancerborealis)、岸蟹(Carcinusmaenas)等神經肽表達水平造成的影響[20, 69]。

實時定量PCR(Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)技術通常用于實現神經肽前體轉錄水平的定量分析，綜合分析神經肽及其前體的表達特征。盡管更多的mRNA通常意味著基因表達增強，但蛋白質表達水平并不總是與mRNA呈正相關，因而mRNA水平和蛋白水平的綜合分析依然是目前神經肽定量研究中的最佳策略。在棘皮動物中，已通過ELISA及qRT-PCR技術分別對海星(Patririapectinifera，Asterinapectinifera)中的性腺刺激物質GSS和Patiriella屬不同發育階段的Engrailed前體等進行了定量分析[70-71]。

3.4 神經肽功能測定研究方法

神經肽在不同組織中可能具有完全不同的功能，即使來自同一家族不同的神經肽同工型，在同一組織也可能產生截然不同的效果。功能研究主要涉及宏觀(例如行為)和微觀(例如信號傳導途徑)兩個層面。在宏觀功能研究中，主要從在體和離體兩個維度來進行。通過劑量依賴性測試獲得神經肽作用的最適濃度后，在在體或離體水平注射，觀察神經肽對組織或者個體造成的影響。在棘皮動物中，該方法集中應用于對肌肉剛度、行為及繁殖的影響，例如，在體或離體注射神經肽結合電生理學的方法研究紅海盤車的PPLN1b、Luqin、VP/OT型等神經肽在肌肉剛度、賁門胃外翻中的功能；在體及離體研究糙海參(Holothuriascabra) TRH/GnRH、刺參NGIWY等神經肽對繁殖的誘導作用等[23,53,63,72-73]。在此過程，電生理學方法被廣泛應用，將距離、剛度等物理信號轉化為電信號是進行功能研究的有效手段，但結果容易受到個體差異的影響，因此實驗對于樣本的數量及重復次數有一定的要求。研究發現電生理學與其他光學成像技術相結合，可定位神經信號，因此將經典電生理學的時間分辨率和光學成像的空間分辨率相結合，將有助于神經科學領域實現重大發現，也是未來研究探索的方向之一。

在微觀層面，通常利用干擾神經肽前體基因的轉錄或表達過程對神經肽及其前體的功能進行研究?；蚓庉嫾夹gCRISPR/Cas9因使用便捷和較高的效率而廣受歡迎，脫靶現象是目前該技術亟待攻克的難點，而且需要成熟的細胞培養技術。在棘皮動物中，基因編輯技術僅在模式生物海膽中成功應用，主要用于查明海膽胚胎發育、攝食習性、體色變化等生理過程中信號傳導通路[74-77]。對于非模式物種，siRNA(Small interfering RNA)技術是CRISPR / Cas9的有效替代方法，siRNA是干擾基因表達的短鏈RNA分子，通過復雜的遞送方法(例如轉染)，或者注射入生物體，可以誘導基因沉默，干擾神經肽的表達。該方法操作相對簡單，但也存在很多問題，例如siRNA在生物體內易被降解，抑制的效果不確定性等，而且siRNA只是抑制基因的表達，未完全阻止其發揮作用，對于神經肽“高效”的作用特點，使得研究結果可能存在偏差。在棘皮動物中，已有研究者通過siRNA技術發現特定基因及蛋白在蝦夷馬糞海膽(Strongylocentrotusintermedius)脂肪酸代謝、刺參免疫防御等方面的潛在作用[78-79]。

4 參與調節棘皮動物生理功能的神經肽

神經肽及其關聯的G蛋白偶聯受體的系統發育分布的研究表明，至少有三十個神經肽信號系統的進化起源可以追溯到兩側對稱動物的共同祖先[80-81]。與其他被充分表征的模式無脊椎動物相比，如黑腹果蠅、秀麗隱桿線蟲和軟體動物加利福尼亞海兔，棘皮動物神經肽信號傳導系統的研究仍處于起步階段。隨著神經肽功能研究技術的不斷革新，越來越多的研究表明神經肽可能參與介導棘皮動物特殊生理現象的調控，包括組織的剛度變化、個體發育及繁殖過程[8, 29, 63, 82]等。

4.1 調控肌肉剛度的神經肽研究進展

棘皮動物具有“可變的結締組織”，使肌肉剛度迅速變化。目前尚不清楚結締組織可變性潛在的分子和細胞機制，但有證據表明神經肽介導了棘皮動物結締組織剛度的神經控制[28]。不同的神經肽家族對于肌肉剛度的影響存在差異。

1991年，García-Arrarás等通過藥理學實驗發現CCK型神經肽可誘導海參(Holothuriamexicana)腸道肌肉松弛，由此開啟了神經肽對棘皮動物肌肉剛度影響的研究[83]。隨著技術的發展和研究的不斷深入，Calcitonin(CT)型、Luqin/RYamide型及stichopin等神經肽在不同物種的組織中都表現出對肌肉剛度的調控能力。例如，CT型神經肽對海星(A.rubens和Patiriapectinifera)頂端肌肉和管足的松弛、Luqin型神經肽對紅海盤車管足的松弛及holokinin 1、holokinin 2和stichopin對刺參體壁結締組織的收縮作用等[73, 84-85]。此外，Elphick等對刺參體壁中分離出的二十種肽序列基于轉錄組數據庫重新進行了比對分析，推測GN-19、GLRFA、SWYG型、KIamide-9等神經肽在縱肌或腸道中起到收縮/舒張的作用[29]。

賁門胃外翻是海星攝食時的特殊行為，這一行為同樣與肌肉剛度變化密切相關。體外藥理學實驗證明，PP/OK型神經肽可以引起海星P.pectinifera(頂端肌肉、管足、賁門胃)、A.rubens(賁門胃)和Asteriasamurensis(頂端肌肉)組織松弛，與原口動物PP/OK型神經肽對肌肉的收縮作用形成對比[10, 86]，表明后口動物和原口動物的分化過程可能伴隨著PP/ OK型神經肽作為肌肉活動調節因子的抑制-興奮性的轉變[53]。GnRH和CRZ型肽均可引起紅海盤車賁門胃、頂端肌肉和管足的收縮[87]，但兩種神經肽的誘導作用似乎具有組織偏好性，例如，GnRH對賁門胃的收縮誘導比CRZ更有效，而在頂端肌肉組織中，CRZ效力更強[82]，這種偏好性的分子機理有待進一步研究。

4.2 調節繁殖行為的神經肽研究進展

許多棘皮動物物種具有極高的營養價值和經濟價值，如海膽、海參等。近年來，野生種群被過度捕撈，種群數量迅速下降，人工育種已成為種群增殖的有效途徑。然而，水產養殖中物種增殖和繁殖面臨巨大挑戰，傳統誘導產卵的方法，如熱刺激等，對親體損害程度較大，具有很多的缺陷。生殖相關神經肽為我們提供了新的研究視角。

海星Asteriasforbesi的橈神經提取物注入該物種后會誘發配子脫落，這是有關無脊椎動物的促性腺激素物質的首個報道[88]，這種活性物質被稱為性腺刺激物質(GSS)，并在生化上被描述為肽激素[89]。Cochran和Engelmann從海膽橈神經中分離出一種5.6 kDa的熱穩定多肽——RNF，可誘導雄性和雌性紫海膽產卵排精[90-91]。同樣有研究發現海參的橈神經粗提物(RNE)和從海膽(e.g.,Echinometramathaei,Stomopneustesvariolaris,Paracentrotuslividus)的卵子提取物中富集的MIF(成熟誘導因子)可以刺激眾多海參物種(H.leucospilota，Holothuriapervicax,Holothuriamoebi,Holothuriapardalis,A.japonicus,H.scabra)卵母細胞的成熟[92-94]，但橈神經提取物的具體成分尚未確定。直到2009年，在海星P.pectini-fera中鑒定出一種蛋白，屬于松弛素型(Relaxin)肽家族，GSS由此被命名為松弛素樣性腺刺激肽(Relaxin-like gonad-stimulating)或RGP[95]。目前，幾種神經肽被驗證具有刺激卵母細胞成熟的功能，包括GSS、RGP、cubifrin(NGIWYamide, NGLWYamide)和QGLFSGVamide。

在海星[89, 96-97]和海參[93, 98]中，卵母細胞的成熟可由GSS直接刺激。例如，GSS誘導的紅海盤車卵母細胞成熟和產卵[96]，而SALMFamide型神經肽可以抑制A.pectinifera性腺刺激物質GSS的釋放[97]。源自A.rubens和P.pectinifera的RGP均可誘導紅海盤車卵巢片段中卵母細胞的成熟和排卵，但AruRGP比PpeRGP效力更強[96]。在另一海星物種——棘冠海星中，體外重組的RGP能夠有效誘導卵母細胞成熟和排卵，由于未成熟的性腺缺乏具有活性的Gαs，RGP僅對處于成熟末期(卵母細胞直徑> 150 μm)的卵母細胞的性腺有效[99]。

Cubifrin-I(NGIWYamide)及衍生物 Cubifrin-L(NGLWYamide)可在體外誘導刺參卵母細胞成熟，促進產卵過程[72, 100-101]。但該肽并非是所有海參物種卵母細胞成熟的“通用誘導劑”，在黑海參中則未發現其誘導作用[102]。最近的研究顯示卵巢壁對于GVBD和卵母細胞成熟十分必要[72]。QGLFSGVamide在濃度大于1 μmol/L時可以誘導刺參生發泡破裂，然而，由于該肽的效力低，因此不建議將該肽作為卵母細胞成熟的主要調節劑[72]。Chaiyamoon等向糙海參注射短的TRH/GnRH樣肽，同樣可顯著加速性腺發育，并刺激配子發生[63]。

值得注意的是，有些神經肽雖然尚未在棘皮動物中進行表征，但已在其他動物中被證明可以調控兩側對稱動物繁殖進程，例如，Kisspeptin型、GnRH/CRZ型神經肽，這將是未來神經肽參與棘皮動物繁殖調控研究的重點。

4.3 參與生長過程的(攝食、變態前附著)神經肽研究進展

動物的生長特征是科學投喂、敵害生物防治、高效養殖過程中十分重要的參考依據，易受遺傳、環境等多種因素的影響。目前關于棘皮動物生長過程的神經調節機制研究尚少。研究表明海膽中insulin(IL)-relaxin家族成員SpILP1和SpILP2(Insulin-like peptide)，可能參與攝食行為的調控，其中SpILP1 神經肽及其前體蛋白的表達與投喂方式密切相關[103]。此外，對促甲狀腺素釋放激素(Thyrotropin-releasing hormone, TRH)及促腎上腺皮質激素釋放激素(Corticotropin-releasing hormone, CRH)型神經肽前體在紅海盤車幼蟲體內定位的研究揭示了TRH及CRH在海星變態前附著過程中具有潛在作用[8]。

4.4 同時調控多種生理進程的神經肽研究進展

神經肽作為生物體內最大、最多樣化的一類信息分子，通常一種神經肽可同時調控多種生理進程。

作為棘皮動物中研究最為充分的神經肽之一，SALMFamide神經肽不僅可以誘導紅海盤車、黑海參和刺參多種組織(管足、肌肉、腸道)的松弛[15-17]，還可以誘導海星賁門胃的外翻，參與攝食調節[16-17]，并能夠抑制Asterinapectinifera性腺刺激物質GSS的釋放[97]。

兩側對稱動物進化過程中高度保守的VP/OT型神經肽除去可以引發棘皮動物海星(A.rubens)賁門胃、頂端肌肉及海膽(S.purpuratus)管足、食道和肌肉組織的劑量依賴性收縮[23, 104]，該神經肽還參與了棘皮動物的攝食行為的調節。此外，通過對VP/OT型神經肽前體的原位雜交定位，發現其在紅海盤車幼蟲的變態前附著過程具有潛在作用[8]。

NG/NPS/CCAP型神經肽家族在棘皮動物中主要表現為NG肽。NG肽家族的成員會引起棘皮動物的肌肉、觸手、管足、食管、腸道等組織的收縮(例如海膽Echinusesculentus和紅海盤車 NGFFFamide、刺參 NGIWYamide)[54, 104-106]。此外，NGFFYamide還可以影響紅海盤車幼蟲口周圍的纖毛擺動，降低運動能力[8, 54]。

4.5 棘皮動物神經肽受體的研究進展

神經肽主要結合并激活G蛋白偶聯受體(GPCR)來發揮作用，GPCR包括六個家族，大多數肽受體屬于視紫紅質rhodopsin或促胰液素secretin家族[107]。相較于脊椎動物，棘皮動物中神經肽受體的研究起步較晚。近年來，隨著組學的發展，棘皮動物基因組、轉錄組及多肽組序列數據相繼發表，為神經肽受體的鑒定提供了可能。目前，在紫海膽、紅海盤車、海星和刺參等物種中分別鑒定到多個GPCR(見表 2)，其中，在紫海膽中最多，為44種。當前在紅海盤車中已鑒定到與VP/OT型、NGFFF型、Luqin型以及Short Neuropeptide F/Prolactin-releasing peptide(sNPF/PrRP)等神經肽的受體，并發現與神經肽結合后在肌肉剛度、攝食、運動等行為中發揮重要作用[23, 54]，sNPF/PrRP神經肽受體的發掘將原口動物sNPF和脊椎動物PrRP連接起來，重建了PrRP/sNPF型神經肽進化歷史[108]。在刺參中，同樣確認了Kisspeptin受體在介導Kisspeptin型神經肽參與刺參的代謝和生殖過程中的關鍵作用[109]。

表2 棘皮動物神經肽受體

5 同一神經肽在不同棘皮動物物種中的功能比較

肽類物質作為細胞間信號分子(神經遞質，神經調節劑或神經激素)釋放，是神經元進化的古老特性。不同物種中同一神經肽的GPCR種類、數量等差異可能會對神經肽的功能或效力產生直接影響，因此同一神經肽在不同棘皮動物中的功能比較有助于更深刻地理解神經肽的作用機制。

VP/OT型神經肽家族在兩側對稱動物中十分保守，可以調節多種功能。在棘皮動物中，通過體外藥理學研究，發現VP/OT型神經肽可誘導紅海盤車賁門胃、頂端肌肉的松弛，這與海膽E.esculentusVP/OT型神經肽促進管足和食道的肌肉收縮作用相反[14, 104, 115]。NG型神經肽NGIWYamide及其衍生物NGLWYamide可在體外誘導刺參卵母細胞成熟，而在黑海參中未發現誘導作用[72, 100-102]。PP/OK型神經肽在后口和原口動物間表現出功能的分化[53]。PPLN神經肽在棘皮動物中可以引起多種海星物種(P.pectinifera、A.rubens、Asteriasamurensis)的肌肉組織松弛，與其在原口動物中的肌肉收縮作用形成對比[10, 86]。

隨著神經肽功能表征的不斷豐富和補充，神經肽在生理調節過程中表現出的“物種特異性”可能會擴展到更多的神經肽家族，那時，對于產生這種差異的內在機制將初見端倪，為進一步了解神經肽如何調節生物體生命活動提供更全面的詮釋。

6 研究展望

過去的十年，神經肽領域取得了快速的發展，神經肽對動物生理、行為的調控一直是研究的重點和熱點?；蚪M、轉錄組序列數據的不斷豐富促進了棘皮動物神經肽信號系統的功能表征[26, 34]。系統發育分析揭示至少30個神經肽信號系統的進化起源可以追溯到兩側對稱動物的共同祖先[81]，對于從功能保守性的角度揭示神經肽家族的生理作用大有裨益。眾多神經肽信號分子的表征為棘皮動物的生殖、攝食及運動等生理過程的調控機制提供了全新的視角，尤其為極具營養價值的海洋經濟物種(紫海膽、刺參等)的健康養殖開辟了更加高效、綠色的途徑[11, 101]；然而在兩側對稱動物中，相較于某些神經肽被充分表征的生物(如加利福尼亞海兔、秀麗隱桿線蟲等)，棘皮動物神經肽研究仍然起步較晚，進展緩慢。因此，部分重要神經肽功能的鑒定和受體家族的發掘，包括在棘皮動物中已被鑒定，并在其他生物中驗證具有重要或者特殊調控功能的神經肽以及棘皮動物中特有的神經肽，將是未來棘皮動物神經肽研究的重點。

6.1 KPP型神經肽(Kisspeptin-type neuropeptide)

2001年孤兒受體GPR54的內源性配體被鑒定，其衍生自轉移抑制蛋白KiSS-1，具有C端RFamide基序，被稱為Kisspeptin[116]。棘皮動物紫海膽、紅海盤車、刺參與脊椎動物斑馬魚(Daniorerio)、海七鰓鰻(Petromyzonmarinus)、智人(Homosapiens)等物種的Kisspeptin型神經肽都具有預測的C末端LxF-NH2基序，而這一特征在半索動物囊舌蟲(Saccoglossuskowalevskii)與頭索動物文昌魚(Branchiostomafloridae)中丟失，而在所有物種中C末端都發生了酰胺化，對該肽的生物活性十分關鍵[117-118]。kisspeptin信號系統生理作用的研究表明，其在調節哺乳動物(如綿羊、豬、大鼠等)的生殖過程和魚類(如青鳉(Oryziaslatipes) 、軍曹魚(Rachycentroncanadum)等)早期發育中具有古老的作用，主要表現為對性腺發育的促進作用、神經肽及受體突變導致的性腺功能減退等方面[119-124]。同時還發現Kisspeptin是HPG軸重要物質GnRH分泌的有效刺激物[117]。例如斑馬魚(Daniorerio)tachykinins家族成員可以與Kisspeptin相互作用以控制GnRH的釋放，從而調節繁殖過程，但這種相互作用的內在機制仍然未知[121]。此外，Kisspeptin可以受胰高血糖素的調控從而抑制胰島素的分泌[125]。Yap等研究發現kisspeptin和生物的晝夜節律有明確的聯系[126]，從而暗示該神經肽可能參與能量平衡和代謝過程。目前該神經肽已在棘皮動物的紫海膽、紅海盤車、刺參及三個海蛇尾物種(Ophionotusvictoriae、Amphiurafiliformis、Ophiopsilaaranea)中得以鑒定[35,37-38,41,43]。近期研究發現，在海參物種——刺參A.japonicus中Kisspeptin型神經肽可參與刺參的代謝和生殖過程[109]。作為多種生理角色的調節者，Kisspeptin在棘皮動物中的功能表征令人期待。

6.2 PDF型神經肽(Pigment-dispersing factor-type neuropeptide)

PDF型神經肽首先在甲殼動物北極甜蝦(Pandalusborealis)中被發現[127]。在目前已被鑒定的棘皮動物中，PDF型神經肽具有兩種亞型，其中紅海盤車、刺參中只有一個亞型C末端發生了酰胺化，紫海膽中兩個亞型C末端均具有該現象，當前這兩種神經肽的活性及功能差異還不明晰[37, 41, 80]。值得注意的是，目前僅在刺參A.japonicus中發現PDF型神經肽衍生自兩個神經肽前體，且其mRNA具有可變剪切現象，而剪切位點位于非活性片段中[37]。因此，關于刺參中兩種PDF型前體同工型發生的功能意義及特殊的可變剪切模式對于深入理解神經肽結構進化意義匪淺。與之相對應，在所有非棘皮動物中，例如秀麗隱桿線蟲(C.elegans)、霸王蓮花青螺(Lottiagigantea)、環節動物海蠕蟲(Capitellateleta)、黑腹果蠅(D.melanogaster)及水熊蟲(Hypsibiusdujardini)等，通常僅具有一種PDF型神經肽，并且C末端均發生了酰胺化修飾[128-131]。

PDF型神經肽已在眾多節肢動物和其他原口無脊椎動物(包括線型動物和冠輪動物)中得到了表征[127-132]。PDF型肽在原口動物中具有多種生理功能，包括調節色素遷移，運動的晝夜節律，產卵和攝食行為[127-129, 132]。棘皮動物中PDF型神經肽已在紫海膽、紅海盤車、刺參及三個海蛇尾物種(O.victoriae、A.filiformis、O.aranea)中被鑒定，但其生理作用尚未在棘皮動物中報道[35, 37-43]。

另有一些神經肽，例如SALMFamide型神經肽，目前僅在棘皮動物中被鑒定，這類物種或者門類特異性以及在序列上與其他物種具有較大差異的神經肽，是否會由序列特異性體現為個體功能或行為的特異性，將為棘皮動物生理調控機制帶來重大見解?；谫|譜和生物信息學鑒定的某些神經肽，在棘皮動物中序列十分保守，例如np8、np9、np11、np15、np17、np18、np20、np21、np23和np25，已在多種棘皮動物物種中被發現，但目前尚未在任何物種中進行功能表征[35,37,38-43]。如何通過功能鑒定和受體發掘來建立更好的系統發育體系使之與現有神經肽家族建立聯系，是深入理解兩側對稱動物神經肽信號系統的進化歷程亟待解決的關鍵問題，將為兩側對稱動物神經肽生理行為調控網絡提供重要的節點。在后基因組時代，棘皮動物特殊的進化地位、成體的五輻對稱、膠原組織的可變性及特殊生理現象也將為兩側對稱動物神經肽功能調控版圖提供獨特視角。