基于代謝組學技術的麻黃湯對發熱模型大鼠解熱作用的初步研究

付新，劉陽，欒詣晗，鄭淇，匡海學

(黑龍江中醫藥大學 教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

麻黃湯為著名的中藥傳統經典方劑，出自漢代張仲景的《傷寒論》[1]。麻黃湯由麻黃、桂枝、杏仁、炙甘草四味中藥組成，是一個被廣泛應用的經典復方?，F代藥理學研究表明，這四味中藥的組方配伍對感冒、流涕、哮喘等疾病具有顯著的療效[2]。在中國，雖然麻黃湯在臨床上被廣泛應用于發熱病人的治療上，但是關于麻黃湯的解熱作用機制研究報導卻很少。有研究報道,通過GC-MS氣質聯用技術，麻黃湯中有40種化學成分被鑒定。通過UPLC-Q/TOF-MS的液質聯用技術在麻黃湯中發現了39種化合物，同時，麻黃湯中的麻黃堿，甲基麻黃堿，苦杏仁苷，甘草酸在比格犬血漿中被發現和鑒定[3-5]。2018年，麻黃湯成為了國家中醫藥管理局公布的第一批古代經典名方[5]。事實上，麻黃湯的作用機制還不清楚，中藥復方研究對于科研工作者是一個巨大的挑戰。

1 材料

1.1 動物

Wistar清潔級大鼠，雄性，體質量為(200±20)g，黑龍江中醫藥大學動物實驗中心提供，許可證號(HUCM-201506912)。所有大鼠在室內保持12 h光照、12 h避光循環飼養，控制室內溫度為(23±2)℃ 、相對濕度在(60±5)%，并在代謝籠中適應1周。給予飲用水和標準飼料。

1.2 儀器

美國超高效液相色譜儀(UPLC-Q/TOF-MS)，工作站MassLynxV4.1，HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm,UK)，歐姆龍牌電子數字式溫度計MC-612型，賽多利斯牌電子天平，KQ-50B超聲波清洗器(杭州微米派科技有限公司)。

1.3 藥品

所選麻黃(批號:1410030M;檢索號:2014-CP-10038)產自內蒙古，桂枝(批號:1312010S;檢索號:2013-CP-012023)產自廣東省，苦杏仁(批號:1401074ch;檢索號:2014-CP-01106)產自河北省，甘草(批號:1503036M;檢索號:2014-CP-03027)產自內蒙古。經黑龍江中醫藥大學藥學院王振月研究員鑒定為麻黃科植物麻黃EphedrasinicaStapf的干燥草質莖，樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl的干燥嫩枝，薔薇科植物山杏的苦杏仁Prunusmandshurica(Maxim.) Koehne干燥成熟種子，豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch的干燥根和根莖。

供試藥品的制備:精密稱取麻黃9 g浸泡在700 mL水中，煮沸30 min，水量減至約500 mL，除去泡沫，再加入桂枝6 g，苦杏仁12 g，炙甘草3 g，煮沸1 h，水量減至約200 mL。重復3次并合并濾液。采用6層紗布過濾，并濃縮成濃度為每毫升含生藥材1 g。

1.4 試劑

酵母菌(GB/T20886)為河北省售品，甲酸(批號:9806684)色譜級，Sigma公司，乙腈(批號:148407)為色譜級，Fisher公司，甲醇(批號:110301)為色譜級，Fisher公司，屈臣氏蒸餾水，亮氨酸-腦啡肽，Sigma公司，氫氧化鈉分析級。

2 方法

2.1 動物分組及實驗

實驗大鼠每日測量肛溫2次，適應后大鼠于代謝籠中分籠飼養適應環境3 d，期間測量溫差變化不超過0.5 ℃的大鼠為合格大鼠。通過預實驗研究結果發現，麻黃湯(4.2 mL/kg)高劑量組的解熱效果明顯高于麻黃湯(2.1 mL/kg)低劑量。所以正式實驗選取麻黃湯(4.2 mL/kg)作為給藥組。將24只健康大鼠隨機分為3組，即空白組、模型組和麻黃湯組。模型組和麻黃湯組大鼠背部皮下注射20%酵母水懸液(15 mL/kg)。實驗組于造模前1 h給予麻黃湯(4.2 mL/kg)1次，空白組和模型組給予同體積的0.9%生理鹽水。

2.2 樣品的采集與制備

在造模后0 h、3 h、5 h、7 h、9 h、12 h、15 h、20 h各時間點分別收集尿液1次。即收集0～3，3～5，5～7，7～9，9～12，12～15，15～20 h共7個時間段的尿液，尿液在13 000 r/min的速度下4 ℃離心15 min，取上清液供UPLC-Q/TOF-MS分析。

2.3 色譜條件

采用98%的A溶劑和2%的B溶劑進行梯度洗脫。流動相A 0.1%甲酸-水溶液，流動相B 0.1%甲酸-乙腈溶液。柱溫40 ℃;流速0.4 mL·min-1。洗脫梯度見表1。

表1 洗脫梯度

2.4 質譜條件

UPLC-Q/TOF-MS質譜中，使用電噴霧離子源(ESI)，應用質譜法技術進行了正負離子模式測量。 所有數據均在m/z100～1 200之間采集。毛細管電壓3.0 kV、錐形電壓45 V、脫溶劑氣流量掃描為600 L/h、脫溶劑溫度為450 ℃、錐孔氣流量為100 L/h和離子源溫度為120 ℃。準確質量校正采用亮氨酸-腦啡肽(leucine-enkephalin)。

2.5 數據處理

采用MarkerLynx XS軟件進行色譜峰識別以及峰匹配，采用Progenesis QI 1.0對代謝組學的原始數據進行處理。利用現有數據庫，包括 KEGG、HMDB、METLIN分析潛在的生物標志物，然后利用MetPA工具分析生物標志物的途徑。采用SPSS軟件對數據進行統計學分析。

3 結果

3.1 麻黃湯對酵母菌致發熱大鼠體溫的影響

實驗結果表明，5～12 h時間段，大鼠體溫在模型組中發生了顯著變化，表明酵母菌已成功誘導發熱模型。與模型組比較，麻黃湯組對酵母菌致發熱大鼠體溫升高有明顯的抑制作用，組間差異均有統計學意義(P<0.05)，如圖1所示。

注：與空白組比較，*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；CG(空白組);PG(模型組);TG(麻黃湯組)。圖1 空白組、模型組和麻黃湯組大鼠直腸溫度

3.2 生物標志物鑒定

在正離子模式下，共鑒定了9個潛在的生物標志物見(表2)，在負離子模式下，共鑒定了4個潛在的生物標志物見(表3)。生物標志物選擇必須滿足以下要求:(1)VIP值大于2;(2)t檢驗結果具有統計學意義;(3)模型組和麻黃湯組呈相反的變化趨勢。如果一個離子滿足以上三個方面，它將被認為是一個潛在的生物標志物。

表2 正離子模式下的潛在生物標志物及其變化趨勢

表3 負離子模式下的潛在生物標志物及其變化趨勢

3.3 麻黃湯對酵母致熱的保護作用

給藥5～12 h時間段，模型組代謝變化大，因此，進一步利用非監督的PCA統計分析方法，分別對空白組、模型組和麻黃湯組進比較。麻黃湯組能夠逆轉發熱模型組的代謝紊亂。采用PCA積分圖(如圖2)，對空白組、模型組和麻黃湯組進行分析，表明它們的代謝特征存在顯著差異，麻黃湯具有調控發熱模型大鼠代謝網絡的作用，使其向正常組回調。不同代謝物的峰面積值，如圖3所示。代謝途徑分析結果，如圖4所示。

注：空白組，模型組和麻黃湯組在正離子(A)和負離子(B)模式下的主成分分析法PCA；空白組，模型組和麻黃湯組在正離子(C)和負離子(D)模式下主成分分析法PCA的3D圖。CG(空白組 綠色)；PG(模型組 黑色)；TG(麻黃湯組 紅色)。圖2 麻黃湯對對酵母菌發熱的代謝輪廓的保護作用

注:與空白組比較,*P<0.05, **P<0.01,***P<0.001;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001。圖3 UPLC-Q-TOF-MS模式下潛在生物標記物的峰值面積水平的變化

注:(1)生物素代謝;(2)核黃素代謝;(3)類固醇激素合成;(4)色氨酸代謝。圖4 用MetPA工具進行路徑分析

3.4 代謝途徑分析

利用MetaboAnalyst代謝分析軟件對麻黃湯的代謝機制進行了研究，并分析了代謝途徑。 Kegg和MetPA數據庫被用來確定麻黃湯干預發熱大鼠模型的代謝途徑，并揭示這些潛在的生物標志物之間的關系。如圖5所示，聚類熱圖顯示了空白組、模型組和麻黃湯組之間的相對值差異。 為了進一步了解不同組之間的代謝差異，代謝產物在一個可視化聚類熱圖中，揭示了每種代謝產物的變化。

注：每個部分的顏色與代謝物的變化(紅色，上調; 藍色，下調)成正比。 行代表樣品;列代表代謝物。不同群體相應標記群體間的相關系數分析。對照組class K(紅色)(K1-K8);模型組class M(綠色)(M1-M8);麻黃湯組class T(T1-T8)(藍色)。圖5 對照組、模型組和麻黃湯組尿液樣本可視化熱圖

3.5 生物標志物的表達水平研究

研究結果表明，麻黃湯通過提高5-甲氧基色氨酸(5-methoxytryptophan)水平達到抗炎的作用。在大鼠的腎臟中，麻黃湯能夠降低6-羥基褪黑素(6-hydroxymelatonin)、黃嘌呤酸(xanthurenic acid)、巴豆酰甘氨酸(tiglylglycine)、同絲氨酸(Homocitrulline)水平；在大鼠的肝臟中，麻黃湯可以降低雄酮葡萄糖醛酸(etiocholanolone glucuronide)、7-酮脫氧膽酸(7-ketodeoxycholic acid)水平，并且升高脫硫生物素(dethiobiotin)、1-甲基腺苷(1-methyladenosine)水平。在生物素代謝途徑中，麻黃湯可以提高生物素(biotin)水平；在核黃素代謝代謝途徑中，麻黃湯提高了核黃素(riboflavin)水平；在類固醇激素合成代謝途徑中，麻黃湯能夠降低雌酮(estrone)、2-甲氧基雌酮-3-葡萄糖醛酸酯(2-methoxyestrone 3-glucuronide)水平最后達到解熱的作用。代謝途徑見圖6。

圖6 麻黃湯解熱作用的代謝途徑

4 討論

生物素( biotin)又名維生素H、維生素B7，是一種水溶性維生素，是人類五種羧基酶的輔酶，即乙酰輔酶A羧化酶1、乙酰輔酶A羧化酶2、丙酮酸羧化酶、丙酰輔酶A羧化酶和3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶[6]。這些酶在脂肪酸、葡萄糖和氨基酸的新陳代謝中起重要作用。 哺乳動物不能合成生物素，而依賴于微生物和植物的攝入。在這個途徑中，脫硫生物素由油酸鹽代謝產物吡美啉輔酶a和氨甲酰磷酸形成[7]。硫再與脫硫生物素結合，生成生物素[8]。生物素長期以來被認為是羧基酶的共價結合輔酶[9]。最近，有證據表明，生物素在細胞信號傳遞、基因的表觀遺傳調控和染色質結構方面也發揮著獨特的作用。人體因缺乏生物素可引起的貧血、脫發、嘔吐、舌炎、情緒抑郁、肌肉痛等癥狀，臨床上常用于濕疹、接觸性皮炎、異常性痤瘡等皮膚病治療;畜禽因缺乏生物素引起的生長遲緩、皮炎、脫毛等癥狀[10]。

在尿液中，雌激素通過雌激素結合物的形式排泄出來，是雌激素受體α和β的特定激動劑。 由于雌激素可以轉化為雌二醇，而雌二醇比雌激素的作用要強得多，體內雌激素效能是因為大部分雌激素轉化為了雌二醇[11-12]。核黃素又叫維生素B2，微溶于水。為體內黃酶類輔基的組成部分，當人體缺乏核黃素時，就會出現機體的生物氧化紊亂和代謝發生障礙。核黃素參與了線粒體電子傳遞鏈，并已用于一些線粒體功能紊亂疾病患者[13-16]。核黃素是已知的線粒體氧化磷酸化的共同因子，也是線粒體呼吸過程中電子運輸所需的黃素前體[17]。核黃素被認為是潛在的生物標志物，它在核黃素代謝途徑在內皮功能障礙大鼠中受到干擾[18]。核黃素缺乏癥會導致疲勞、喉嚨腫脹、視力模糊和抑郁。 核黃素缺乏癥還影響皮膚，引起皮膚裂紋，瘙癢，和皮炎等疾病[19]。 最重要的核黃素生物活性形式是黃素腺嘌呤二核苷酸和黃素單核苷酸，參與一系列的氧化還原反應，對有氧細胞功能具有重要作用[20]。

羥基褪黑素是一種天然存在的內源性神經遞質蛋白，是神經遞質褪黑激素的主要活性代謝產物。 科學家發現羥基褪黑素是MT1和MT2受體的激動劑。同時，羥基褪黑素具有抗氧化和神經保護作用，說明褪黑激素的具有多全面的保護作用[21-23]。一些研究發現褪黑激素的突然增加會導致生殖障礙和抑郁癥。

黃嘌呤酸定位于中樞神經系統的神經元中[24]。黃嘌呤酸尿一種少見的遺傳性、嘌呤代謝障礙性疾病，當體內缺乏黃嘌呤氧化酶時，黃嘌呤不能被解體，而是大量積聚在體內，致使血和尿中的黃嘌呤濃度急劇升高。黃嘌呤酸水平的增加是由于上調犬尿氨酸途徑影響四氫生物蝶呤的生物合成和四氫生物蝶呤依賴途徑[25]。

甘氨酸是異亮氨酸分解代謝的中間產物，它也被認為是呼吸鏈相關疾病的診斷標記物，并且所有患者的的尿液中甘氨酸含量均升高。這是第一個在尿液中與呼吸鏈紊亂相關的潛在的標記物[26]。

7-酮脫氧膽酸是一種膽汁酸，影響肝功能的脂質代謝和膽汁酸的腸肝循環[27]，體內積累過多會產生強烈的毒性(如破壞細胞膜)。此外，在新陳代謝中，7-酮脫氧膽酸代謝障礙可能導致肝炎及肝硬化[28-29]。同時，7-酮脫氧膽酸也是丙烯酰胺致肝損傷的潛在生物標志物[30]。

5-甲氧基色氨酸預防和治療膿毒癥相關性肺損傷。與健康人相比，膿毒癥患者血清5-甲氧基色氨酸水平降低到35%。因此，5-甲氧基色氨酸是抗炎分子的生物標志物，可以預防內皮屏障功能障礙和過度全身性炎癥[31-32]。 麻黃湯可能通調節預酵母菌模型大鼠體內的潛在生物標志物含量變化，干預了大鼠紊亂的代謝途徑，從而達到預防與治療疾病的目的。

本文研究了酵母菌致發熱模型大鼠尿液的代謝標志物和代謝途徑。采用UPLC-Q/TOF-MS代謝組學研究方法，結合多元統計分析，建立了麻黃湯解熱機制的代謝組學方法。研究發現了13個與發熱相關的潛在生物標志物。同時，研究結果還表明，麻黃湯可能通過調節多種代謝途徑，對酵母菌引起的發熱具有預防作用。通過代謝途徑分析，麻黃湯的解熱作用可能通過調節生物素代謝、核黃素代謝、類固醇激素合成和色氨酸代謝等主要代謝途徑實現的。