單細胞拉曼光譜在環境解磷微生物中的應用研究

林紹敏，李弘哲，崔 麗

（1. 中國科學院城市環境研究所 中科院城市環境與健康重點實驗室，福建 廈門 361021；2. 福建農林大學 生命科學學院，福建 福州 350000）

0 引言

磷是農業生產中必需的營養元素之一，是植物組織和細胞組成的重要元素，參與作物生長過程中的一系列生理生化過程。磷素的缺乏會導致植株生長緩慢，根系發育不全，降低作物的產量和品質等問題［1］。磷肥是農業生產所需的三大肥料之一，生產磷肥的主要原料來自磷礦石，磷礦石是一種不可再生資源［2］。根據2017 年的統計數據，全球磷肥消耗量約為5 000 萬t/a，預計2030 年將增至7 000萬t/a，磷素正在快速“消逝”。施用磷肥是土壤磷的主要來源。然而，所施用磷肥會被土壤固定，難以被植物直接吸收利用，造成磷肥利用率低［3］。長期施用磷肥使土壤形成一個巨大的累積態“磷庫”，亟須一把合適的“鑰匙”開啟這個“磷庫”，緩解磷資源短缺問題，促進農業生產的可持續發展。

解磷微生物可以通過分泌有機酸（包括葡萄糖酸、草酸、蘋果酸、檸檬酸等）降低土壤pH，促進礦質磷的溶解，同時能與Fe3+、Al3+、Ca2+等陽離子螯合，通過與磷酸根離子競爭土壤中相同的吸附位點，釋放磷酸根離子［4］。除此以外，解磷微生物還可以通過釋放磷酸酶活化土壤有機磷，使固定態磷向生物有效態磷轉變［5］。在實際農業生產過程中，施用解磷菌劑可以降低磷肥施用量，促進土壤磷循環。因此，解磷微生物對于土壤磷的生物地球化學循環起著重要作用，對維持土壤生態系統平衡與農業可持續發展具有重要意義［6］。目前，對解磷微生物的獲取往往依賴于純培養技術。然而，超過99%的微生物不可分離純培養，大量解磷微生物資源未被挖掘和利用［4］。開發一種不依賴純培養的解磷微生物及其活性檢測技術，對解析環境中解磷微生物的群落、功能、活性和代謝通路等具有重要意義。

1 單細胞拉曼光譜解析高活性解磷菌的原理和應用

為了克服純培養的限制，筆者所在團隊近期研發了單細胞拉曼光譜結合重水同位素標記的新技術，實現了土壤中高活性解磷微生物（包括未培養部分）的原位研究［7］。單細胞拉曼光譜可對單個微生物細胞進行檢測，無須培養。它可以快速無損地獲取細胞內不同生物分子的振動光譜，包括核酸、蛋白質、脂類、色素（如細胞色素c 和類胡蘿卜素）和聚合物等［8］。通過這些譜圖的變化鑒別微生物細胞的生理性狀和應激響應等信息。更重要的是，拉曼光譜還可與13C、15N或2D等穩定同位素標記（SIP）結合，提供真實的微生物功能和代謝活性等信息。它利用活性細胞同化同位素標記底物后，新合成生物分子化學鍵中的輕原子被重同位素取代，造成化學鍵振動頻率下降，拉曼峰發生偏移。該拉曼峰偏移，可作為微生物功能或活性的標志峰［9］。例如，利用重水同位素標記時，活性微生物同化氘并代替氫進行合成代謝，使得構成生命體的重要生物分子，如脂類、蛋白質、DNA 等被氘化，所產生的新的C—D 鍵可被拉曼光譜靈敏檢測到，并且C—D 峰強度還可反映微生物的新陳代謝活性［10-11］。

對于解磷微生物，也可以利用拉曼光譜結合重水同位素標記技術進行研究?；驹硎牵毫姿貙ξ⑸锏幕钚云鹬P鍵作用。僅固定態磷存在條件下，解磷菌可以分解利用難溶性磷，同化重水中氘進行新陳代謝，因此仍具有代謝活性，產生C—D鍵（特征鍵）拉曼峰，而非解磷菌無法進行正常的新陳代謝，難以同化氘。因此，通過拉曼光譜中C—D 鍵拉曼峰的強弱，可快速區別解磷菌和非解磷菌，并根據解磷微生物的代謝活性（即C—D 鍵拉曼峰強度），反映其解磷能力。另外，由于重水標記不會改變環境的營養底物庫，因此，可以在不影響微生物生存環境條件下，真實反映土壤微生物的解磷能力。單細胞水平檢測，也能克服純培養的限制，識別土壤中未培養的解磷微生物。

利用單細胞拉曼光譜分別檢測微生物在含有可溶性磷和不含磷培養液中的代謝活性，發現在含磷培養液中，微生物具有明顯的C—D 峰；而在不含磷培養液中的微生物沒有C—D 峰（見圖1），說明磷對微生物活性具有決定性作用。進一步利用難溶磷酸鈣（無機磷）和卵磷脂（有機磷）作為唯一的無機或有機磷源，將4 種不同的解磷菌進行孵育。研究結果表明，4種解磷菌的C—D峰強度具有顯著差異，且C—D 峰強度與傳統方法檢測的可溶性磷濃度或酸性磷酸酶活性基本一致（見圖2 和圖3），說明了單細胞拉曼光譜和重水標記方法研究不同細菌解磷能力的準確性。

圖1 4種菌劑在含磷和不含磷的50%重水培養液中孵育24 h后的拉曼光譜

圖2 以卵磷脂作為唯一有機固定態磷源培養后磷酸酶活性與C—D峰強度

圖3 以磷酸鈣為唯一無機固定態磷源培養后可溶性磷濃度與C—D峰強度比值

在此基礎上，將該方法從純菌拓展至復雜的土壤環境。在已去除可溶性磷的土壤中添加重水進行原位孵育，并利用拉曼光譜在單細胞水平檢測土壤提取微生物的C—D 峰（見圖4）。研究發現，土壤微生物拉曼光譜中存在不同強度的C—D 峰，說明復雜多樣的土壤中的微生物具有不同的解磷活性。進一步結合拉曼成像，實現在不依賴純培養的條件下，識別土壤中的高效解磷微生物（見圖5）。I和II分別是利用C—H和C—D拉曼峰進行成像，C—H區分生物和非生物質，C—D 區分解磷菌?？梢?，含C—H 的微生物明顯多于含C—D 的微生物，說明土壤中僅部分菌具有解磷活性。

圖4 在無可溶性磷土壤中加入重水孵育24 h后土壤微生物的單細胞拉曼光譜

圖5 土壤中提取微生物和少許土壤殘留拉曼成像

單細胞拉曼光譜解析土壤高活性解磷菌的關鍵步驟：首先，受試土壤須去除其中的有效磷，如利用水和NaHCO3進行孵育和離心清洗；其次，在洗去有效磷的土壤中加入一定量的D2O，該同位素標記物是檢測微生物解磷能力的必要試劑；再次，利用密度梯度離心法將土壤微生物從土壤中提取分離出來，避免檢測時土壤顆粒對微生物的干擾；最后，利用共焦顯微拉曼光譜儀對提取的土壤微生物進行單細胞水平檢測，并利用拉曼光譜中C—D 峰強度評價解磷能力或活性。

2 傳統解磷微生物研究方法與單細胞拉曼光譜方法對比

不同解磷微生物的研究方法均存在優缺點，具體見表1。傳統解磷微生物的研究方法，主要是從復雜的生態環境中分離、純化、培養出解磷微生物，通過研究溶磷量和生長速率表征微生物的解磷能力［12］。另外，由于解磷菌在無機磷溶解過程中會釋放無機酸和有機酸，酸化細菌培養基。因此，測定培養基的pH 也可反映微生物的解磷能力［13］。然而，這種依賴分離、純化、培養解磷微生物進行微生物特征分析的方法受多種因素干擾，部分微生物因為缺乏合適的培養基、培養溫度不適宜、自身生長弊端和缺乏共生體等原因無法在培養基中進行純培養。即使是從復雜環境中提取培養的解磷微生物，也不能全面真實地反映它們在環境中的活動［14］。此外，解磷菌能夠釋放非特異性酸性磷酸酶和植酸酶，促進有機磷活化，且研究發現各形態磷含量與酶活性顯著正相關，尤其是酸性磷酸酶。因此，微生物酶活性也是表征解磷微生物解磷能力的手段之一［15］。但是，由于植物也分泌磷酸酶，干擾微生物解磷活性的測定，且其僅反映有機解磷菌的活性，無法判斷無機解磷菌的活性，造成方法具有局限性。除此以外，總碳、總氮等土壤特征與酸性磷酸酶的活性密切相關，也可間接反應微生物的解磷能力［16］。

表1 解磷微生物研究方法對比

不依賴培養的分子生物學技術已被廣泛應用于微生物群落結構和功能多樣性研究［17］。土壤宏基因組測序可揭示微生物解磷相關的功能基因，功能基因定量PCR（聚合酶鏈反應）技術可定量微生物解磷相關功能基因豐度［18］。然而，上述技術僅從基因型角度表征解磷微生物的解磷潛力，不能反映微生物真實具有的解磷能力。除此以外，這些方法還具有科研材料費用昂貴、測序和檢測過程過于煩瑣、耗時長等問題。

相比于解磷菌培養和分子生物學技術，單細胞拉曼光譜-重水同位素標記聯用技術克服了解磷微生物純培養的限制，可直接從土壤環境中尋找解磷菌，并且是具有真實解磷（包括對無機磷與有機磷的溶解）能力的微生物。

3 展望

目前單細胞拉曼光譜結合重水技術已被應用于復雜土壤環境中檢測高效解磷菌的研究。在未來工作中，該技術還能夠用于評價不同土壤微生物的解磷能力，并逐步發展成衡量土壤健康這一重要指標的依據。同時，單細胞拉曼光譜結合分子生物學手段，還可促進對“以碳促磷”等重要微生物學機制的深入認識；結合轉錄組和蛋白組等多組學手段，可深入探究解磷微生物在土壤生態系統中響應多級磷素轉化的分子調控機制；結合色譜分析，有望更直觀探究有機磷農藥在土壤生態系統中的遷移和轉化。另外，由于拉曼光譜近乎無損檢測，結合單細胞分選，還可對拉曼光譜檢測的高效解磷菌進行分選、測序，甚至培養，促進新型解磷菌種和新型功能基因的挖掘，以及解磷微生物資源的實際農業利用。

然而，單細胞拉曼光譜目前還無法實現大樣本的高通量檢測以及便攜式的實時快速檢測。今后還需發展針對土壤微生物的快速和高通量樣品處理方法。另外，由于微生物之間交互飼喂（cross-feeding）對重水標記復雜微生物群落中的解磷微生物的干擾，還需發展合適的重水孵育方式和裝置，降低該干擾。此外，還需發展可對微生物進行快速在線檢測的便攜式拉曼光譜儀，以促進拉曼光譜方法的現場應用。