叢毛紅曲菌固態發酵山藥產莫納可林K的影響因素研究

覃學領，吳佩芝，余伊鑫，余 翔，馮艷麗*

（1.特色野菜良種繁育與綜合利用技術湖北省工程研究中心，湖北黃石 435002；2.湖北師范大學食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室，湖北黃石 435002；3.湖北師范大學生命科學學院，湖北黃石 435002；4.湖北師范大學生物學國家級實驗教學示范中心，湖北黃石 435002）

山藥（Dioscorea opposite）是我國藥食同源材料的杰出代表，可根據口感、形狀、產地及含水量等將其分為水山藥、長山藥、鐵棍山藥、普通山藥等[1]。鐵棍山藥呈圓柱形，表皮有紫斑和疙瘩且毛須分布稠密，口感綿軟，質地細膩。鐵棍山藥又分為沙土鐵棍山藥和壚土鐵棍山藥。壚土鐵棍山藥外形彎而細、粗細不均，而沙土鐵棍山藥外形直而粗、粗細均勻。普通山藥又叫菜山藥，形狀不規則，具有表皮光滑、毛孔稀疏、含水量高、纖維粗糙、易折斷及易腐敗的特點[2]。

山藥中淀粉含量豐富，然而產地和生長環境可影響山藥的基因型和表型，其淀粉特性也差異較大[3]。干山藥的淀粉含量范圍為66.21%～68.88%[4-5]。新鮮壚土鐵棍山藥和新鮮沙土鐵棍山藥淀粉含量分別為19.29%和15.31%[2]。除淀粉外，山藥還富含多種營養及功效成分，如蛋白質、氨基酸、多糖、皂甙、糖蛋白等[6]。另外，山藥中含有的18種氨基酸包含人體必需的8種[6]，具有抗糖尿病、調理脾胃、保護肝臟等功效[3]。目前，山藥多用于生產初級加工產品，如山藥果脯、山藥掛面、山藥脆片、山藥飲料等，其附加值仍有待提升[7-8]。山藥的精深加工及新產品開發，可大幅提升山藥附加值，是該行業亟待解決的關鍵問題之一。

紅曲在我國有2 000多年的應用歷史，為充分利用山藥的營養及功效成分如淀粉、多糖及氨基酸等，可考慮將其作為紅曲菌（Monascusspp.）的發酵基質生產功能性紅曲。功能性紅曲一般是指紅曲菌發酵淀粉質原料所得的可調節血脂功效成分莫納可林K（monacolin K，MK）含量≥0.4%的紅曲產品[9]。除MK外，紅曲菌可代謝產生天然著色劑紅曲色素（Monascuspigments）、可改善睡眠并降低血壓的抑制性神經遞質γ-氨基丁酸等[10]。山藥中淀粉多為直鏈淀粉，易被微生物利用，有利于紅曲菌生長[11]。目前，已有文獻報道紅曲發酵山藥的相關研究，紅曲山藥不僅安全性高，還對小鼠酒精誘導的肝損傷具有保護作用[12-13]。然而，山藥紅曲中MK的產量仍有待進一步提升。

本研究以新鮮山藥為發酵基質，以叢毛紅曲菌（Monascus pilosus）MS-1為實驗菌株，采用固態發酵山藥，探究了新鮮山藥和干山藥、山藥品種、蔗糖、山藥塊莖大小、乳酸等因素對發酵山藥中MK產量的影響因素。以期為提升山藥的附加值，開發新型功能性紅曲產品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與材料

叢毛紅曲菌（Monascuspilosus）MS-1（CCTCCM2013295）：從市售紅曲米中分離的可高產MK、不產生桔霉素的紅曲菌株，于中國典型培養物保藏中心保藏。

新鮮沙土鐵棍山藥及新鮮壚土鐵棍山藥：均產自河南焦作；新鮮普通山藥a和新鮮普通山藥b：購于湖北黃石菜市場；干山藥：產自河南焦作。

1.1.2 試劑

葡萄糖、蔗糖（均為分析純）、蛋白胨、瓊脂（均為生化試劑）、乙腈（色譜純）：國藥集團化學試劑有限公司；MK標準品（純度＞98%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.3 培養基

種子液培養基[14]：葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫銨、七水硫酸鎂和無水氯化鈣含量分別為80 g/L、10 g/L、2 g/L、0.5 g/L和0.1 g/L。將土豆去皮后稱取200 g，切塊后放入蒸餾水中，加熱并維持微沸20 min。紗布過濾后所得的濾液代替蒸餾水與上述試劑混勻，定容至1 000 mL。pH自然，1×105Pa滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potatodextroseagar，PDA）[15]：將土豆削皮后稱量200 g，將其切成約2 cm3的方塊后放入適量蒸餾水中。加熱至煮沸后維持微沸狀態20 min。用紗布過濾后取濾液，量取適量的蒸餾水補足至1 000 mL。加入葡萄糖及瓊脂粉各20 g，加熱直至葡萄糖和瓊脂粉完全溶解。在1×105Pa的條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

LRH-80型生化培養箱、DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥機：武漢一恒蘇凈科學儀器有限公司；UV-5100B型紫外分光光度計：上海元析儀器有限公司；KQ-250DE型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；安捷倫1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）：安捷倫科技有限公司；InertsilODS-3色譜柱（4.6mm×250mm，5 μm）：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 山藥形狀對新鮮山藥含水量的影響

將普通新鮮山藥a分別切成薄片（1 cm×1 cm×0.2 cm）和方塊狀（1 cm×1 cm×1 cm），測定水分含量。

1.3.2 山藥紅曲固態發酵

叢毛紅曲菌種子液的制備參照文獻[15]進行。將培養好的叢毛紅曲菌種子液以13%的接種量接種于裝有50 g山藥的250 mL錐形瓶中，先在30 ℃培養60 h，再轉入25 ℃繼續培養至14 d。將發酵14 d的山藥紅曲在55 ℃烘干12 h，粉碎至80目備用[16]。

1.3.3 叢毛紅曲菌發酵山藥產MK的影響因素研究

（1）新鮮山藥和干山藥對菌株MS-1固態發酵山藥產MK的影響

以普通新鮮山藥a和普通干山藥a為基質，將普通新鮮山藥和普通干山藥均切成1 cm3的方塊，調整上述基質含水量為33%[15]。裝料量為50 g/250 mL，在1×105Pa滅菌20 min并趁熱打散，將菌株MS-1分別接種于上述培養基中。按照方法1.3.2進行固態發酵。采用高效液相色譜（HPLC）法測定發酵產物中MK的含量。

（2）新鮮山藥品種對菌株MS-1固態發酵山藥產MK的影響

分別以新鮮的沙土鐵棍山藥、壚土鐵棍山藥、普通山藥a和普通山藥b作為發酵基質，山藥切成1 cm3的方塊。調整水分含量為33%，裝料量為50 g/250 mL，在1×105Pa滅菌20 min并趁熱打散，將紅曲菌MS-1分別接種于上述培養基中。按照方法1.3.2進行固態發酵，采用HPLC法測定發酵產物中MK的含量。

（3）蔗糖添加量對菌株MS-1固態發酵山藥產MK的影響

選取山藥品種為沙土鐵棍山藥，水分含量調整為33%，山藥切成1 cm3的方塊，裝料量為50 g/250 mL，在1×105Pa滅菌20 min并趁熱打散，將菌株MS-1分別接種于上述培養基中。分別調整培養基中蔗糖添加量分別為3%、6%、9%、12%、15%，以不添加蔗糖的處理為對照（CK）。按照方法1.3.2進行固態發酵，采用HPLC法測定發酵產物中MK的含量。

（4）山藥塊莖大小對菌株MS-1固態發酵山藥產MK的影響

選取山藥品種為沙土鐵棍山藥，水分含量調整為33%，蔗糖添加量為3%，調整山藥體積分別為0.25 cm×0.25 cm×0.25 cm、0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm、1 cm×1 cm×1 cm、2 cm×1 cm×1 cm、3 cm×1 cm×1 cm。裝料量為50 g/250 mL，在1×105Pa滅菌20 min并趁熱打散，將菌株MS-1分別接種于上述培養基中。按照方法1.3.2進行固態發酵，采用HPLC法測定發酵產物中MK的含量。

（5）乳酸添加量對菌株MS-1發酵山藥產MK的影響

選取山藥品種為沙土鐵棍山藥，水分含量調整為33%，蔗糖添加量為3%，調整山藥體積為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，調整培養基中乳酸添加量分別為0.1%、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%，以不添加乳酸的處理為對照（CK）。裝料量為50g/250mL，在1×105Pa滅菌20 min并趁熱打散，將菌株MS-1分別接種于上述培養基中。按照方法1.3.2進行固態發酵，采用HPLC法測定發酵產物中MK的含量。

1.3.4 分析檢測

（1）水分含量的測定

新鮮山藥水分含量測定參考國標GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》中的直接干燥法。

（2）MK含量的測定

采用前期優化的HPLC法檢測山藥紅曲中MK的產量[16]。準確稱取0.30 g山藥紅曲粉末，加入體積分數75%乙醇10 mL，輕微振蕩使其混合。室溫條件下超聲提取1 h（功率為40 W），取出放置冷卻至室溫。取提取液在8 000 r/min離心10 min，取上清液于波長505 nm處測吸光度值（OD505nm值）。取離心后上清液過0.22 μm濾膜，用于HPLC法檢測MK的含量。采用的流動相為乙腈∶水∶0.5%磷酸（60∶37∶3，V/V），流速為1 mL/min。色譜柱為InertsilODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫為25 ℃，進樣量為20 μL，檢測波長為238 nm。

定性與定量分析：結合QB/T 2847—2007《功能性紅曲米（粉）》及課題組前期建立的方法[16]，通過MK在HPLC檢測過程中的保留時間對酸式及內酯式MK進行定性，再利用其峰面積對其定量。MK含量的計算公式如下：

1.3.5 數據處理

數據處理和圖表繪制采用SPSS 19.0和Origin 9.0。

2 結果與分析

2.1 山藥形狀對含水量的影響

薄片狀新鮮普通山藥水分含量為（73.786±1.074）%，方塊狀新鮮普通山藥水分含量為（80.659±0.317）%。由測定結果可知，方塊狀的新鮮山藥水分揮發更徹底，對新鮮山藥中水分含量的測定更為準確。其原因可能是相比于方塊狀山藥，在干燥過程中薄片狀山藥容易發生黏連，水分不易揮發。因此，新鮮山藥的水分含量為（80.659±0.317）%，與已有研究結果基本相符[17]。

2.2 叢毛紅曲菌固態發酵山藥產MK的影響因素研究

2.2.1 普通新鮮山藥和普通干山藥對菌株MS-1固態發酵

山藥產MK的影響

普通新鮮山藥和普通干山藥對菌株MS-1固態發酵山藥中MK產量的結果見圖1。

由圖1可知，菌株MS-1發酵普通干山藥a和普通新鮮山藥a所得山藥紅曲中MK含量較低，均未達到功能性紅曲對MK含量的基本要求[9]。分析其原因是該配方不利于紅曲菌的生長及MK的產生。與普通干山藥a相比，菌株MS-1發酵普通新鮮山藥a所得山藥紅曲中MK含量較高，這可能與山藥干燥過程中營養成分的部分損失有關[18]。因此，選取新鮮山藥為發酵基質，在后續實驗中將進一步優化培養基基質，提升山藥紅曲中MK的產量。

圖1 新鮮普通山藥a和干山藥a對莫納可林K產量的影響Fig. 1 Effects of fresh yam a and dry yam a on monacolin K production

2.2.2 新鮮山藥品種對菌株MS-1固態發酵產MK的影響

新鮮山藥品種對菌株MS-1固態發酵山藥中MK產量的結果見圖2。

圖2 新鮮山藥品種對莫納可林K產量的影響Fig. 2 Effects of fresh yam varieties on monacolin K production

由圖2可知，菌株MS-1發酵沙土鐵棍山藥和壚土鐵棍山藥產MK的量顯著高于兩種普通山藥（P＜0.05）。相比普通山藥，鐵棍山藥水分含量及粘液質相對較少，發酵過程中可保持較高的溶氧量，更利于叢毛紅曲菌的生長及代謝產物的產生[19-21]。菌株MS-1發酵沙土鐵棍山藥和壚土鐵棍山藥所得發酵產物中MK的產量無顯著性差異（P＞0.05）。因此，選擇營養價值相對較低、含水量較高且較為不易貯藏的沙土鐵棍山藥[2]為發酵基質，開展后續的實驗，以最大限度降低生產成本并提高其附加值。

2.2.3 蔗糖添加量對菌株MS-1固態發酵山藥產MK的影響

結合前期研究結果，與葡萄糖相比，在培養基中添加少量蔗糖可促進紅曲菌產生MK[16]。蔗糖添加量對從毛紅曲菌固態發酵山藥中MK產量的結果見圖3。

葡萄糖對叢毛紅曲菌固態發酵山藥中MK產量具有一定促進作用。由圖3可知，以不添加蔗糖的發酵基質為對照，當蔗糖添加量為3%時，MK產量達到最高，為9.93 mg/g，隨著蔗糖添加量增加至15%，山藥紅曲中MK產量逐漸下降。在叢毛紅曲菌發酵過程中添加少量外源碳源，可以促使菌株MS-1在發酵初期快速生長，減少污染雜菌幾率。當外源碳源過多時，可能造成菌株MS-1生物量增加，MK產量逐漸下降，其原因是MK等次級代謝產物常在叢毛紅曲菌處于逆境脅迫（如碳饑餓等）條件下產生和積累[22-24]。因此，選擇蔗糖添加量3%為宜。

圖3 蔗糖添加量對莫納可林K產量的影響Fig. 3 Effects of sucrose addition on monacolin K production

2.2.4 山藥塊莖大小對菌株MS-1固態發酵山藥產MK的影響

山藥塊莖的大小可影響菌株MS-1生長的表面積以及發酵過程中的通氧量，山藥塊莖大小對菌株MS-1固態發酵山藥中MK產量的結果見圖4。

圖4 山藥塊莖大小對莫納可林K產量的影響Fig. 4 Effects of yam tuber size on monacolin K production

由圖4可知，當山藥體積分別為0.25cm×0.25cm×0.25cm、0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm時，MK產量逐漸增加，當山藥體積大小為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm時，MK產量達到最高，為7.42 mg/g，隨著山藥塊莖體積的繼續增加，MK產量下降。其原因是若山藥體積過小則易造成山藥塊體之間的黏連，不利于發酵。而山藥體積（0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm）時，山藥塊莖表面積適中，菌株MS-1可以附著生長的基質表面相對較多，更利于菌株MS-1利用基質內部的碳源及氮源等營養物質，因此更利于菌株MS-1固態發酵山藥產MK。山藥體積為3 cm×1 cm×1 cm和2 cm×1 cm×1 cm所得發酵產物中MK的產量無顯著性差異（P＞0.05）。當山藥體積增加，山藥內部通氧量不足，因為菌株MS-1主要在表面生長，導致MK產量整體偏低。因此，選擇山藥塊莖大小0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm為宜。

2.2.5 乳酸添加量對菌株MS-1固態發酵山藥產MK的影響紅曲菌嗜酸，添加乳酸可使基質在發酵初期減少雜菌污染的同時，促進紅曲菌生長[23]。乳酸添加量對菌株MS-1固態發酵發酵山藥中的MK產量的結果見圖5。

圖5 乳酸添加量對莫納可林K產量的影響Fig. 5 Effects of lactic acid addition on monacolin K production

由圖5可知，與對照組（CK）相比，隨著乳酸添加量在0～0.3%范圍內的增加，MK產量呈上升趨勢，當乳酸添加量為0.3%時，MK的產量達到最高值，最高值為8.10 mg/g，高于紫色紅曲菌（Monascus purpureus）NTU301發酵山藥所得MK產量2.58 mg/g[26]。繼續增加乳酸添加量至1.2%，MK產量呈下降趨勢。乳酸添加量為0.9%和1.2%所得發酵產物中MK的產量無顯著性差異（P＞0.05）。由于叢毛紅曲菌嗜好乳酸，添加乳酸有利于叢毛紅曲菌生長及次級代謝產物的產生[25]。然而，添加過多的乳酸會造成培養基pH偏離叢毛紅曲菌發酵山藥產MK的最適條件[15]。因此，選擇添加0.3%的乳酸為宜。

3 結論

本研究采用山藥作為發酵基質，以叢毛紅曲菌MS-1為菌種，探究叢毛紅曲菌固態發酵山藥中MK產量的影響。結果表明，塊狀山藥優于片狀山藥，新鮮山藥優于干山藥。當發酵基質為新鮮沙土鐵棍山藥、蔗糖添加量3%、山藥塊莖大?。?.5cm×0.5 cm×0.5 cm）、乳酸添加量0.3%時，叢毛紅曲菌固態發酵山藥中MK產量可達8.10 mg/g。本研究可為提高山藥產品的附加值，豐富功能性紅曲產品類型提供參考。