玫瑰橙子果酒混菌發酵工藝優化

艾小滿，唐 菁，趙興秀，方 歡，劉程陽，張 柱，劉苑皓，李仕魯

（四川輕化工大學生物工程學院，四川宜賓 644000）

橙子果酒富含多種維生素和氨基酸，極具保健功能，具有較高的研究價值[1]。隨著我國經濟的不斷發展，以橙子柑桔類水果為代表的水果產量和種類也在不斷增加，而橙子的鮮食消費市場卻相對有限，拓展銷路成為了解決橙子積壓問題的首要方法。為了提高酒體的色澤、增加果酒的揮發性香氣成分，本試驗在以玫瑰、橙子為原料的基礎上增添了玫瑰茄，并加入庫德畢赤酵母進行混菌發酵。通過單因素試驗以果酒發酵的溫度、時間、初始糖度、混菌接種比例、混菌接種量以及玫瑰和玫瑰茄的添加比例為條件變量，對果酒發酵最適條件進行探索，利用正交試驗確定果酒發酵的最佳工藝參數。采用頂空固相微萃取-氣質聯用(HS-SPME-GCMS)技術對玫瑰橙子果酒的揮發性香氣進行檢測。結果表明，加入了玫瑰茄和畢赤酵母后的玫瑰橙子果酒抗氧化性更強，揮發性香氣更多，色澤艷紅，香氣醇厚，口感柔和。

1 材料與儀器

1.1 材料、試劑及儀器

原料：橙子、玫瑰、玫瑰茄、白砂糖本地市售。

菌種：拉曼德·釀酒酵母（憨酒匠自釀坊），庫德畢赤酵母（實驗室篩選），其他試劑均為國產色譜純和分析純。

儀器設備：氣相色譜儀（6890N-5975B 氣質聯用儀），安捷倫科技(中國)有限公司；頂空固相微萃取-氣質聯用(HS-SPME-GC-MS)；V-1000 可見分光光度計，翱藝儀器(上海)有限公司；SHP-80 生化培養箱，常州普天儀器制造有限公司金壇市晶玻實驗儀器廠；甜度折光儀，ATC。

1.2 試驗方法

1.2.1 玫瑰橙子果酒釀造工藝

原料預處理（干玫瑰花、玫瑰茄粉碎；新鮮橙子浸泡清洗，去皮榨汁）→原料混合→護色殺菌→成分調整→酵母接種→主發酵→倒酒→陳釀→脫苦澄清→巴氏消毒→玫瑰橙子果酒成品

1.2.2 單因素和正交試驗

為了使混菌釀造的玫瑰橙子果酒達到較高的酒精度及較好的感官指標，先經過單因素試驗考察玫瑰及玫瑰茄添加比例、發酵時間、菌株接種量、發酵初始糖度、發酵溫度等因素對混菌發酵玫瑰橙子果酒品質的影響，再以pH 值、吸光度、酒精度、總酸、殘糖和果酒成品的感官評分為試驗指標，進行L9（33）正交試驗[2]。

1.2.3 玫瑰橙子果酒產品質量測定

采取國標測定方法[3]對每天發酵過濾后果酒的pH 值、總酸、殘糖、吸光度及發酵3 d、4 d、5 d 的果酒的酒精度進行測定。再將發酵所得玫瑰橙子果酒經過濾后，由10 人組成的感官評定小組對玫瑰橙子果酒的色澤、香氣、口感三方面進行感官評分。評分標準見表1。

1.2.4 玫瑰橙子果酒抗氧化性研究

酚類的一般特征是結構中羥基與苯環直接相連，是極好的氫或電子供體，由于形成的酚類游離基中間體的共振非定域作用和沒有適合分子氧進攻的位置，比較穩定，不會引發新的游離基或由于鏈反應而被迅速氧化，所以是很好的抗氧化劑[4]。本試驗采取福林酚法[5]測定玫瑰橙子果酒多酚類含量。黃酮類物質是廣泛存在于植物中的天然產物，具有多種生理調節功能，并可清除自由基，發揮抗氧化功能，保護細胞膜的完整性[6-7]。果汁中的黃酮含量和抗氧化活性之間有顯著的相關性[8-9]。本試驗采取絡合比色法[10]測定玫瑰橙子果酒中黃酮類物質含量。

表1 感官評分標準

1.2.5 玫瑰橙子果酒揮發性香氣成分檢測方法

運用HS-SPME 法[11]萃取玫瑰橙子果酒揮發性香氣成分，為了使固定相更好的附在柱子的內壁上，第一次使用時需于氣相色譜進樣口230 ℃，老化2 h，高溫可以去除一些雜質和溶劑，看到氣相上的基線平穩后進行下一步操作。取玫瑰橙子新酒6 mL 于15mL頂空瓶中，加入1.2 g NaCl 封 口，50 ℃下于磁力攪拌器上平衡20 min，插入老化2 h的萃取纖維頭吸附30 min，于進樣口解析3 min，然后收集數據。

色譜條件：（色譜柱：C18管柱，進樣口溫度250 ℃載氣(He)：流量1.0 mL/min，不分流進樣）程序升溫:起始溫度35 ℃，保持5 min，以5 ℃/min 進樣升至110 ℃，保持2 min，再以6 ℃/min 進樣升至150 ℃，保持2 min，最后以8 ℃/min 進樣升至250 ℃，保持10 min[11]。

質譜條件:離子源溫度250 ℃，離子化方式EI，電子能量70 eV，分辨率1000，質量范圍為30～500 u/s[12]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 玫瑰花、玫瑰茄添加比例對玫瑰橙子果酒品質的影響

設定玫瑰花與玫瑰茄添加比例分別為4∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶4；果酒發酵初始糖度為24°Bx，酵母接種量為6.0 %，發酵溫度為25 ℃，玫瑰和玫瑰茄與橙汁比例（質量比g/mL）為5∶100，發酵5 d，過濾，通過感官評定和理化指標檢測玫瑰花、玫瑰茄添加比例對果酒風味的影響，結果見表2。

由表2 可以看出，不同玫瑰花、玫瑰茄的添加比例對玫瑰橙子酒的品質有較大影響，其中玫瑰茄的比重越大，口感越酸，酒體的顏色越深，香氣越濃。發酵5 d 的5 組酒精度都達到10.9 %vol，其殘糖也在8.0 °Bx 左右，除去實驗儀器及發酵過程測定的誤差影響，5 組所達到的酒精度以及殘糖相差無幾，但總酸和pH 值的測定結果卻略有不同。因此玫瑰花、玫瑰茄的不同添加比例不會影響果酒的酒精度，但會影響果酒的pH 值和總酸含量。分析其原因，玫瑰茄中總酸含量高達75%，所以玫瑰茄的比重越大，果酒的pH 值越小，總酸含量越高，因此添加玫瑰茄可能只對發酵酒的香味及口感有所影響，而對酵母的新陳代謝無太大影響。對發酵所得玫瑰橙子果酒經過濾后，以10 人組的感官評定結果得知玫瑰花、玫瑰茄比為1∶1 組的感官綜合評分高達80 分，其果酒色澤呈艷紅色，澄清，無懸浮物；香氣相對濃郁。所以，最終選取玫瑰花、玫瑰茄添加比例為1∶1。

表2 不同玫瑰花、玫瑰添加比例的果酒理化性質測定結果及綜合評分

表3 不同釀酒酵母、畢赤酵母接種比例的果酒理化性質測定結果及綜合評分

2.1.2 釀酒酵母、畢赤酵母接種比例對玫瑰橙子果酒品質的影響

設定釀酒酵母與畢赤酵母接種比例分別為1∶4、2∶3、1∶1、3∶2、4∶1；固定其他發酵條件，發酵后過濾，通過感官評定和理化指標檢測混菌接種比例對果酒風味的影響，結果見表3。

由表3 可以看出，接種畢赤酵母對果酒的色澤影響不大，但對果酒的口感和香氣有一定的影響。發酵5 d 的玫瑰橙子果酒從理化性質的測定結果來看，5 組所達到的酒精度為10.5 %vol～13.9 %vol，總酸為8.75～9.27 g/L 變化，幅度較大，殘糖達到一個平衡值9.0 °Bx 左右，說明畢赤酵母的比重對玫瑰橙子果酒的發酵有一定影響。再由感官評分結果可以看出，當畢赤酵母比重過大時，其果酒的口感及香氣效果反而變差，分析其原因可能較多的畢赤酵母產香，少數的釀酒酵母發酵產酒精，從而導致果酒品質不佳。以10 人組的感官評定結果得知釀酒酵母、畢赤酵母的比例為1∶1 的感官綜合評分高達85 分，其果酒色澤呈深紅色，澄清，無懸浮物；香氣濃郁，純正協調；口感微苦，酸味適中。所以，最終選取釀酒酵母、畢赤酵母的接種比例為1∶1。

2.1.3 發酵時間對果酒的影響

以玫瑰橙子果酒發酵時間為變量，固定其他工藝條件，發酵后過濾，通過感官評定和理化指標檢測發酵時間對果酒的影響，結果見表4。

由表4 可看出，不同發酵時間對玫瑰橙子果酒的酒精度以及果酒品質有顯著影響，酒精度隨發酵時間的延長而變化，直到發酵到第5 天后酒精度達到最高值13.8 %vol，而整體果酒的色澤、香氣、口感在5～6 d 達到最佳，此外pH 值呈先下降后上升趨勢，總酸呈先上升后下降趨勢，最終達到9.88 g/L左右。分析其中的原因，當玫瑰橙子果酒在正常發酵情況下，隨著發酵時間的延長，其糖分逐漸被消耗，酒精度升高，高酒精度對酵母菌有抑制作用，因此達到一定酒精度后便下降。以10 人組的感官評定結果得知，發酵時間5 d 組的感官綜合評分高達86 分，其果酒色澤呈艷紅色；果香濃郁；滋味略酸。所以，最終選取發酵時間為5 d。

2.1.4 混菌接種量對果酒的影響

設定果酒混菌接種量分別為2 %、4 %、6 %、8%和10%；固定其他工藝條件，發酵后過濾，通過感官評定和理化指標檢測混菌接種量對果酒風味的影響，結果見表5。

由表5 可以看出，不同混菌接種量對玫瑰橙子果酒的酒精度以及果酒品質有一定影響，發酵5 d后的玫瑰橙子果酒酒精度和吸光度隨發酵酵母接種量的增加而先升高后降低，總酸呈下降趨勢，pH值無較大變化，當酵母接種量達到6 %時，其果酒品質和酒精度達到最佳狀態。分析其中的原因，當玫瑰橙子果酒在正常發酵情況下，酵母接種量多的其生長繁殖所需要消耗的糖分越多且釀酒酵母和畢赤酵母在一定量下存在著某種拮抗作用導致接種量達到6 %后其酒精度下降同時果酒品質隨著下降。以10 人組的感官評定結果得知，酵母接種量6%組的感官綜合評分高達88 分，其果酒色澤呈艷紅色，有光澤，無懸浮物；酒香濃郁優雅，香味純正協調；口感柔和，酸甜適中。所以，最終選取混菌接種量為6%。

表4 不同發酵時間的果酒理化性質測定結果及綜合評分

表5 不同酵母接種量的果酒理化性質測定結果及綜合評分

2.1.5 初始發酵糖度對果酒的影響

設定玫瑰橙子果酒發酵初始糖度分別為18°Bx、20 °Bx、22 °Bx、24 °Bx、26 °Bx；固定其他工藝條件，發酵5 d 后過濾，通過感官評定和理化指標檢測初始發酵糖度對果酒風味的影響，結果見表6。

由表6 可以看出，隨著初始糖度的增加，果酒發酵后酒精度也隨之升高，說明初始發酵糖度對酒精度影響顯著，此外，pH 值也處于一個穩定值，而總酸和吸光度有一定的變化，說明初始糖度對pH值無顯著影響，但對總酸和吸光度有影響。分析其中的原因，在玫瑰橙子果酒正常發酵情況下，高濃度糖可以給釀酒酵母提供更多的碳源進行新陳代謝，從而利用原料中的糖合成酒精，當酒精濃度達到一定階段后對其他香氣成分有所壓制。以10 人組的感官評定結果得知，初始發酵糖度24°Bx組的綜合評分高達90 分，其色澤艷紅，無懸浮物；果香、酒香濃郁，純正協調，酒質平衡，口感柔和。所以，最終選取發酵初始糖度為24°Bx。

這里將語境分為特定話語(問句)所適應的語境和話語建構后新生成的語境兩大類。其中每一類又都可以有文本語境和非文本語境。

2.1.6 發酵溫度對果酒的影響

設定玫瑰橙子果酒發酵溫度分別為22 ℃、25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃；固定其他工藝條件，發酵5 d 后過濾，通過感官評定和理化指標檢測發酵溫度對果酒風味的影響，結果見表7。

由表7 可以看出，不同發酵溫度對果酒的酒精度以及品質有顯著影響，發酵5 d 后的玫瑰橙子果酒隨著溫度升高，酒精度先增高后降低，當發酵溫度達到28 ℃時，酒精度達到最高，果酒感官效果達到最佳，然后隨著溫度升高酒精度下降，果酒品質也隨之下降。分析其原因可能是溫度較低時酵母的活性受到抑制，代謝不旺盛致使發酵效果較緩慢；當溫度較高時，前期發酵較快，酒精度在短時間內快速上升，加上畢赤酵母代謝活動旺盛，釀酒酵母代謝活動受到抑制。以10 人組的感官評定結果得知，發酵溫度28 ℃組的感官綜合評分高達90分，果酒色澤呈艷紅色，澄清透明；果香濃郁；酒體協調。所以，最終選取控制發酵溫度為28 ℃。

2.2 正交試驗結果及分析

上述單因素試驗分析結果表明，初始糖度、混菌添加比例、混菌接種量對果酒品質的影響最大，故以初始糖度（A）、混菌添加比例（B）、混菌接種量（C）進行3 因素3 水平正交實驗，其發酵分析結果及感官評分見表8。

由表8 可以看出，感官評分分析各因素的極差值為（RA=12.00）＞（RC=6.66）＞（RB=6.33），即影響玫瑰橙子果酒發酵及品質的主次因素為發酵糖度（°Bx）＞混菌接種量（%）＞混菌接種比例；經理化指標檢測第5 組的pH 值最高、總酸含量偏低、吸光度適中，且感官評分最高達到95 分，所以試驗的最優組合為A2B2C3。即以發酵初始糖度為24°Bx，混菌接種量為7 %，混菌接種比例為1∶1 得到的玫瑰橙子果酒口感，色澤，香氣最佳。

表6 不同初始發酵糖度的果酒理化性質測定結果及綜合評分

表7 不同發酵溫度的果酒理化性質測定結果及綜合評分

表8 發酵條件優化正交試驗結果

表9 單菌發酵果酒、混菌發酵理化性質測定結果及綜合評分

2.3 驗證試驗

將單菌發酵果酒和正交試驗確定最優條件的混菌發酵果酒進行3 次發酵試驗，最后測得結果的平均值見表9。

2.4 玫瑰橙子酒抗氧化性研究

2.4.1 多酚類物質含量的測定結果（圖1、圖2）

圖1 沒食子酸標準曲線

圖2 單菌發酵與混菌發酵多酚含量對比

將平行測定結果的平均值進行線性回歸，得到沒食子酸含量（X）與吸光度（Y）之間的直線方程y=12.9x+0.0432（R2=0.9982）。

由圖2 可以看出，單菌發酵多酚含量為172.398 mg/L（樣品中的總多酚含量以沒食子酸計）?；炀l酵多酚的含量為199.385 mg/L，混菌發酵多酚的含量比單菌增加了15.65 %，其原因可能是畢赤酵母在發酵過程中產多酚的能力比釀酒酵母強。

2.4.2 黃酮類物質含量的測定結果（圖3、圖4）

圖3 蘆丁標準曲線

圖4 單菌發酵與混菌發酵黃酮含量對比

將平行測定結果的平均值進行線性回歸，得蘆丁含量（X）與吸光度（Y）之間的直線方程y=8.4032x-0.0063（R2=0.9983）。樣品中的總黃酮含量以蘆丁含量表示。

由圖4 可以看出，單菌發酵黃酮含量為36.7568 mg/L，混菌發酵黃酮含量為40.7168 mg/L，混菌發酵較單菌發酵黃酮的含量增加了13.49 %，其原因可能是畢赤酵母的代謝作用使玫瑰、玫瑰茄花萼中的黃酮進一步釋放，使得混菌發酵黃酮含量較單菌發酵有所上升。

2.5 GC-MS揮發性香氣物質分析

以正交試驗確定的最佳發酵條件與單菌發酵條件作比較，研究玫瑰橙子果酒發酵的揮發性香氣物質。玫瑰橙子果酒揮發性香氣成分的GC-MS檢測結果如表10。

由表10 可以看出，單菌發酵的玫瑰橙子果酒共檢測出33 種揮發性香氣物質，其中醇類物質14種（89.297%）；酯類物質有11 種（3.846%）；酚類物質有3 種（0.766%）；酸類物質3 種（1.139%）；烯類物質2 種（0.109 %）?；炀l酵的玫瑰橙子果酒共檢測出33 種揮發性香氣物質，其中醇類物質12 種（86.354%）；酯類物質有11 種（3.972%）；酚類物質有3 種（0.830%）；酸類物質4 種（1.571%）；烯類物質2種（0.123%）。此外，混菌發酵的玫瑰橙子酒還產生了乙酸乙酯、丁酸乙酯、苯甲酸乙酯、月桂酸、茴香腦等香味物質。

雖然混菌發酵制成的玫瑰橙子果酒醇類物質和烯類物質含量相對較低，但是酯類物質和酚類物質相對含量較高?；炀l酵產生的(+)-檸檬烯、己酸乙酯、辛酸乙酯、芳樟醇、苯乙醇含量遠高于單菌發酵。許多證據支持檸檬烯在癌癥預防和治療中有作用，由于可抑制膽固醇合成的限速酶活性，從而有可能抑制膽固醇的合成[13]；己酸乙酯具有曲香、菠蘿香型的香氣[14]；辛酸乙酯具有白蘭地酒香味[15]；芳樟醇具有鈴蘭香氣[16]；苯乙醇具有清甜的玫瑰樣花香[17]。

3 結果與討論

試驗表明，混菌發酵橙子玫瑰果酒的最佳配方為：玫瑰花、玫瑰茄的添加比例為1∶1，釀酒酵母、畢赤酵母的接種比例為1∶1，發酵初始糖度為24°Bx，混菌接種量為7%，果酒發酵溫度為28 ℃，發酵5 d所得到的玫瑰橙子果酒品質最佳，其色澤優美，香氣醇厚，口感柔和。通過抗氧化性實驗研究結果得出，混菌發酵后果酒多酚含量為199.385 mg/L，較單菌發酵增加了15.65 %，黃酮含量為40.7168 mg/L，較單菌發酵增加了13.49%。經GC-MS 分析表明，混菌發酵玫瑰橙子果酒多了5 種揮發性香氣成分?；炀l酵與單菌發酵相比，所含的同類揮發性香氣成分含量大大提高，揮發性風味物質更多。

表10 玫瑰橙子果酒香氣成分的GC-MS檢測對比結果