CD44?配體相互作用的生物力學與功能調控1)

李林達 丁奇寒?, 陳深寶?, 呂守芹?,,2) 龍 勉?, 郭興明,3)

?(重慶大學生物工程學院,生物流變科學與技術教育部重點實驗室,重慶 400044)

?(中國科學院力學研究所生物力學與生物工程中心,中國科學院微重力重點實驗室,工程化構建與力學生物學北京市重點實驗室,北京 100190)

??(中國科學院大學工程科學學院,北京 101408)

引言

CD44 (cluster of differentiation 44)是一種I 型跨膜糖蛋白,廣泛分布在心臟、肝臟、腎臟、脾臟、肺等組織器官中,表達細胞包括內皮細胞、間充質細胞、造血干細胞,以及單核、巨噬、嗜中性粒、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞等血細胞,同時還包括中胚層來源的細胞等[1].CD44 在多種生理和病理過程中發揮作用,如器官形成、造血、淋巴細胞活化、腫瘤轉移及免疫反應[2]等,同時是淋巴癌、前列腺癌、宮頸癌、腫瘤干細胞及早期動脈粥樣硬化的標志物[3].其中通過CD44?配體相互作用介導的細胞?細胞之間或細胞?基質之間的粘附及胞內信號轉導通路是CD44在炎癥級聯反應、腫瘤轉移、淋巴細胞歸巢等生理、病理過程中發揮作用的重要途徑.因此,考察CD44與不同配體相互作用的反應動力學及其介導的細胞粘附動力學與胞內信號通路特征是闡釋其功能的基礎.同時,炎癥級聯反應、腫瘤轉移或淋巴細胞歸巢等過程均發生在血流剪切的力學環境中,血流對細胞的剪切會轉化為CD44?配體相互作用的外力,從而調控其分子間相互作用.此外,免疫細胞的募集、歸巢或癌細胞的轉移還受到基底硬度等其他力學微環境的調控.因此,進一步考察外力作用如何通過調控CD44?配體相互作用反應動力學進而調控細胞粘附動力學從而實現特定生物學功能是理解CD44 功能的另一重要內容.基于此,本文將重點介紹CD44?配體相互作用在免疫反應過程中的作用及機制研究進展.

1 CD44 概述

人源CD44 是由11 號染色體單拷貝編碼的跨膜糖蛋白[4],按照轉錄方式不同可將CD44 前體信使RNA(messenger RNA,mRNA)的20 個外顯子分為組成型和變異型拼接外顯子,進而分別轉錄成標準型CD44(CD44s)和變異型CD44(CD44v),而CD44v 又可以通過可變區域的選擇性拼接得到不同變異體亞型[4].目前發現人類至少有數十種CD44 的可變剪切體[1],其中最常見的亞型包括CD44v4-7,CD44v8-10,CD44v3-10 和CD44v1-10[5].不同亞型的CD44表達部位不同,CD44s 主要分布于間質及造血源性細胞,而CD44v 主要分布于上皮源性細胞和腫瘤細胞.另外,CD44 可進行N 糖基化、O 糖基化翻譯后修飾.最常見的人源CD44s 由361 個氨基酸組成(～37.2 kD),經過糖基化修飾加工[6],蛋白質分子量可達80～100 kD[7];而變異型CD44v 分子量變化范圍約為80～250 kD.采用原子力顯微鏡(atomic force microscopy,AFM)技術掃描CD44 蛋白的大小,結果顯示CD44 高度為2.3±1.4 nm,三維尺寸約為25 nm×30 nm×2.5 nm,與免疫球蛋白大小相類似[8-9].

CD44 結構從胞外N 末端至胞內C 末端包含胞外域、跨膜域和胞內域3 部分.胞外域又可分為氨基末端和近膜域.氨基末端是含有6 個保守半胱氨酸殘基的球狀結構域,其中保守半胱氨酸形成的二硫鍵是N 末端球狀結構域正確折疊及結構穩定性的基礎[10].標準型CD44s 的氨基末端球狀結構域與跨膜段之間是一段由46 個氨基酸形成的莖狀區[11],保守性較低,可被高度糖基化并包含蛋白水解切割位點[12].而不同剪接體CD44v 的可變區可插入在N 末端球狀結構域與莖狀區之間[13].CD44 跨膜區和胞內區序列高度保守,其跨膜區結構支持其在細胞膜上的寡聚化(oligomerisation),并有助于其定位在富含糖脂的膜微區(glycolipid enriched membrane microdomains)[14],以及其與脂筏的作用[15].CD44 的胞內區含有與細胞骨架錨定蛋白(ankyrin)和ERM(ezrin,radixin,moesin)蛋白的結合位點.Merlin 蛋白(moesin-ezrin-radixin-like protein)也可與CD44 胞內端發生相互作用[16].對于CD44s,ERM 蛋白與細胞骨架錨定蛋白分別與其胞內段的292～300,304～318位氨基酸結合[17].由蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)觸發,CD44 胞內尾端絲氨酸(Ser)殘基的有序磷酸化和/或去磷酸化,將增強ERM 蛋白與CD44 的結合[18].激活的ERM 蛋白N 末端與CD44 胞內域結合,而其C 末端與F 肌動蛋白結合,因此,ERM 蛋白是將CD44 連接至肌動蛋白細胞骨架的橋梁蛋白[19],可啟動CD44 下游的胞內信號傳導途徑,行使特定的生物學功能.CD44 潛在的N 糖基化位點(天冬酰胺(Asn)殘基)多數位于胞外域的N 末端結構域或可變區,而O 糖基化位點(絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)殘基)和GAG 附著物(GAG attachments)(Ser-Gly 多肽)則主要分布在胞外的細胞膜近端區域和可變區[20-21].

2 CD44 ?配體相互作用在炎癥級聯反應中的作用

炎癥反應(inflammation)是一種由損害或損傷刺激所誘發的適應性反應(adaptive response),分為急性(acute)和慢性(chronic)炎癥反應[22].多數急性炎癥反應由病毒感染或者機體組織損傷引起,首先由組織中駐留的巨噬細胞和肥大細胞通過Toll樣受體(toll-like receptors,TLRs)和NOD 樣受體(nucleotide-binding oligomerization-domain protein-like receptors,NLRs)等啟動感染識別[23],隨后產生趨化因子、細胞因子、血管活性胺(vasoactive amines)等多種炎性介質,引發局部炎癥,進而通過炎癥級聯反應募集血流中的白細胞遷移穿過毛細血管后微靜脈(postcapillary venules)到達炎癥部位,吞噬病原體[24].白細胞從血流向炎癥部位募集主要包括被血管內皮細胞捕獲,在內皮細胞表面滾動、粘附、爬行,最后跨內皮遷移等級聯過程.該級聯反應由系列受體?配體相互作用介導,同時受到基質硬度、血流剪切等力學微環境調控.已有研究表明,表達在白細胞上的糖蛋白PSGL-1 (P-selectin glycoprotein ligand 1)與表達在內皮細胞上的選擇素(selectin)的相互作用主要介導初期的捕獲與快速滾動過程,CD44 ?配體相互作用則主要介導白細胞的慢速滾動,而整合素?配體相互作用則主要介導后期的穩定粘附、爬行等過程[25].下文將重點介紹CD44?配體相互作用在炎癥級聯反應過程中的作用.

2.1 CD44 配體——選擇素

I 型跨膜蛋白選擇素是CD44 介導細胞?細胞粘附的主要配體之一,包括P,E 與L 選擇素3 個家族成員,其結構從胞外N 末端至胞內C 末端依次包括鈣型凝集素結構域(calcium-type lectin domain,Lectin)、類上皮生長因子樣結構域(epidermal growth factor-like module,EGF),起粘附補體蛋白作用的多個重復序列(consensus repeats,CR)、跨膜區域(transmembrane,TM)和胞內區(cytoplasmic,Cyto).三者之間的區別是P,E 與L 選擇素分別含有9,6,2 個CR結構域,從而具有不同長度[26-27].盡管具有相似結構,但是3 種選擇素具有不同生物學功能.L 選擇素在造血干細胞和成熟白細胞上高表達,并且L 選擇素容易水解,即使在沒有化學因子的刺激下,力學因素如流體剪切即可以使得中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophil,PMN)上L 選擇素發生水解[28];P 選擇素主要表達在血小板和內皮細胞,并分別儲存在α 顆粒和Weibel-Palade 小體中,而促炎刺激可促使P 選擇素通過細胞內儲藏小體與質膜的融合,從而迅速從α顆粒轉移至細胞表面;E 選擇素主要表達在血管內皮細胞上,其表達水平受到炎癥介質的調控.在人源血管內皮細胞中,由腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α),脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)誘導上調表達的主要是E 選擇素[29].

簡言之,CD44?選擇素相互作用,尤其是E 選擇素,是介導炎癥反應中免疫細胞募集的重要分子體系.與E 選擇素與E 選擇素配體-1(ESL-1)、E 選擇素與PSGL-1 相互作用體系相比,三者在炎癥反應中具有比較明確的功能分工.PSGL-1 主要在初期白細胞捕獲過程中起作用;ESL-1 在初期捕獲到穩定慢速滾動過程中起作用;而CD44 則主要介導慢速滾動[35].

2.2 CD44 配體——透明質酸

透明質酸(hyaluronic acid,HA)是脊椎動物中細胞外基質的重要組成部分.HA 是葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖通過交替β-1,4 和β-1,3 糖苷鍵結合的具有重復二糖單元的線性聚合物,典型分子量約為1 MDa,長度可達微米量級,在多種病理、生理過程(如炎癥反應、免疫應答、胚胎發生、腫瘤發展、骨關節炎和動脈粥樣硬化)中起重要作用[37-39].目前觀點認為,低分子量HAHA(LMW-HA)起到促進炎癥的作用,而高分子量HAHA(LMW-HA)具有抑制炎癥的作用[40].低分子量HA 與CD44 相互作用可促進細胞釋放IL-10 和轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1),加劇炎癥反應[41].低分子量HA還可以上調CD44 表達,同時增加蛋白激酶δ(PKCδ)和蛋白激酶ε(PKCε)表達,并對軟骨細胞產生損傷,增強炎癥反應.而中、高分子量HA 對軟骨細胞無作用,并且高分子量HA 可抑制PKCδ,PKCε,核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)的活化和炎癥反應[42].另外,HA 片段上調CD44 和TLR-4 表達,激活NF-κB易位并增加有害細胞因子TNF-α,IL-6 和IL-1β 分泌.特異性CD44 阻斷抗體可降低CD44 和細胞因子表達水平[43].

CD44 可通過兩種方式與HA 相互作用,一是細胞膜定位的CD44 通過特異性相互作用將可溶性HA 錨定在細胞膜上;二是免疫細胞或癌細胞表達的CD44 與其他細胞膜表達或錨定的HA 相互作用直接介導細胞粘附.細胞表面高表達的CD44 與富含HA的胞外基質相互作用是介導腦癌細胞侵襲的主要分子體系,并且癌細胞在遷移過程中呈現獨特的微觸角結構[44].與CD44?選擇素相互作用類似,CD44-HA相互作用介導的細胞粘附同樣在炎癥反應中起重要作用,其中報道最多的是其介導的T 淋巴細胞歸巢過程.在化學因子PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)誘導條件下,T 淋巴細胞上CD44 與內皮細胞上HA相互作用介導其滾動粘附[45].而且,T 細胞的活化增加其表面CD44 與內皮細胞上HA 的結合能力.在體研究表明,注射超抗原葡萄球菌腸毒素B 后,T 細胞募集到發炎腹膜部位依賴于CD44 和HA 之間的相互作用[46];TNF-α 誘導的炎癥小鼠模型中Th1 和Th2 細胞在體內的滾動粘附同樣依賴于CD44-HA相互作用[47].另外,CD44 也是整合素VLA-4(integrin α4β1)-VCAM-1(vascular cellular adhesion molecule 1)相互作用介導T 細胞在內皮細胞上穩定粘附的必要條件[48].此外,CD44-HA 相互作用同樣可以介導中性粒細胞向炎癥部位的募集[49-50].另一方面,CD44-HA 相互作用受到多種因素的調控.細胞表面HA 延伸形成的纜狀結構可促進巨噬細胞在特定炎癥組織的定位[51].CD44 胞外域糖基化程度以及CD44 胞質端特定絲氨酸殘基磷酸化均會調控其與HA 的結合能力[52].抗原受體、細胞因子(如IL-2)、腫瘤壞死因子(TNF)以及趨化因子(包括MIP-1β(macrophage inflammatory protein 1 β),IL-8 和RANTES 等)均可激活CD44、從而進一步增強其與HA 的結合促進T 細胞粘附[53].而IL-1α,IL-1β,IL-3,粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素γ (IFN-γ)和LPS 等均可通過TNF 誘導外周血單核細胞上CD44 與HA的結合[54-55].綜上所述,CD44-HA 相互作用是介導生命體免疫反應的重要分子體系.

CD44-HA 相互作用在肝臟免疫中的作用更為凸顯.HA 在肝臟中的表達相對于其他器官更高,而且主要分布在肝血竇內[56].肝血竇作為肝臟內特化的毛細血管網絡,是肝臟免疫發生的主要場所.與經典炎癥級聯反應中白細胞的募集動力學不同,白細胞在肝臟免疫過程中的募集主要發生于肝血竇內,僅有20%～30%的白細胞在肝血竇后微靜脈粘附.由于肝血竇內皮細胞上極少量表達選擇素,白細胞在肝血竇內的募集不會發生滾動粘附[57].根據誘發因素不同,肝血竇內的中性粒細胞主要通過兩種途徑發生募集.在肝臟無菌炎性損傷中,凋亡細胞釋放的DAMPs(damage associated molecular patterns)直接或間接激活中性粒細胞,并刺激內皮細胞上調表達ICAM-1(intercellular cell adhesion molecule-1),進而與中性粒細胞上的粘附分子整合素αMβ2發生相互作用,介導中性粒細胞粘附,隨后中性粒細胞在肝內駐留的巨噬細胞— 枯否氏細胞(kupffer cell)等— 分泌的趨化因子梯度引導下進行定向爬行,到達特定位點進行跨膜遷移進入損傷組織.而在有菌炎癥(如內毒素血癥和革蘭氏陰性菌敗血癥等)過程中,高水平LPS 的刺激促炎因子IL-10 表達上調、進而抑制αMβ2的表達,此時CD44 取代行使功能,通過與HA相互作用介導中性粒細胞募集[58].CD44 敲除可有效降低LPS 刺激條件下中性粒細胞的粘附[59].更進一步,阻斷CD44-HA 相互作用有效降低了LPS 小鼠肝血竇內中性粒細胞的粘附,而對其在竇后微小靜脈內的滾動粘附過程則沒有影響,而且在此過程中起作用的CD44 是中性粒細胞上而不是內皮細胞上表達的CD44[56].另外,一種血清來源的HA 相關蛋白SHAP 通過與HA 共價結合形成HA/SHAP 復合物,可顯著增強HA 與CD44 的相互作用[60].

簡言之,CD44-HA 相互作用是介導免疫過程中白細胞募集的另一重要分子體系.但是相對于在經典炎癥反應中起重要作用的選擇素?PSGL-1、選擇素?CD44 等分子體系而言,CD44-HA 相互作用更具有其器官特異性,尤其是在肝臟免疫中起重要作用,但是其分子機制尚不明確,其主要原因在于HA 分子量的多樣性及不同組裝形式.比如,不同分子量的可溶性HA 對炎癥反應效果不同,而不同分子量膜定位的HA 對介導細胞粘附有什么樣的差異？其不同組裝形式對細胞粘附的調控？膜定位條件下CD44-HA相互作用反應動力學特性與其他細胞粘附分子配體相互作用反應動力學之間的區別等問題,目前均不明確.

3 CD44 ?配體相互作用的反應動力學及力學調控

受體?配體相互作用反應動力學是調控細胞粘附動力學的基礎.分子間相互作用分為三維、二維反應兩種形式.三維反應是指特異性相互作用的分子雙方至少有一種在溶液中處于游離態(如血液中血漿蛋白和抗體),具有空間三維運動自由度,因而易于與另一種分子發生相互作用;三維反應表征的是大量分子的統計平均性質,通?？捎么_定性化學反應動力學理論來描述,常用的實驗測量方法包括表面等離子共振(surface plasmon resonance,SPR)等.二維反應是指特異性相互作用的分子雙方分別被錨定在兩個表面上,僅具有沿表面面內擴散的二維運動自由度,但缺乏沿垂直于表面法向運動的自由度(如白細胞或內皮細胞表面的選擇素配體相互作用等);因為接觸面受限,二維反應中參與作用的分子數目少,表征的是有限數目受體?配體間結合和解離的隨機動力學行為;而且,二維反應形成的分子復合物為兩個相對表面之間提供了直接的物理連接,因此其反應動力學還受到外力及其他物理因素的調控,具有力學?化學耦合特征.常用的實驗測量方法包括原子力顯微鏡、生物膜力探針(biomembrane force probe,BFP)等典型的分子生物力學測量手段[61-62].

為進一步理解CD44 ?選擇素、CD44-HA 相互作用介導的細胞粘附動力學差異,以下著重介紹該分子體系的反應動力學特征及其力學調控規律.目前已報道的分子層次三維反應動力學參數匯總于表1 中.在無外力作用下,E 選擇素與PSGL-1 相互作用的負反應率koff與E 選擇素與CD44 相互作用基本相當,而正反應率kon略低,進而導致其解離常數KD(KD=koff/kon)略高,也就是說E 選擇素與CD44相互作用結合更快.雖然不同文獻報道的具體數值有差異,但是二者間的相對趨勢保持不變.如果是E選擇素?PSGL-1,E 選擇素?CD44 兩對分子體系與CD44-HA 相互作用去比較,后者的正反應率顯著升高,而負反應率沒有太大差異,最終導致其解離常數KD遠低于E 選擇素配體相互作用,表明CD44-HA相互作用的結合更快、更穩定.一個例外是當HA 分子量為6.4 kD 時,其與CD44 相互作用的負反應率koff明顯高于其他分子量HA,提示特別低分子量的HA 與CD44 相互作用較弱.另外,從已有數據可以看出,當HA 分子量>100 kD 時,其與CD44 相互作用的正反應率從6.4,31 kD 時的～104M?1s?1顯著升高至106～107M?1s?1,表明CD44-HA 相互作用能力與HA 的分子量密切相關.而只有HA 寡糖大于20 個殘基才能有效與CD44 結合[63].

力學調控下不同分子間相互作用反應動力學參數匯總于表2 中,主要是基于AFM 技術對不同CD44亞型配體相互作用的測量.結果顯示:在大致可比的加載率條件下(0.46～4.58 或0.45～5.22 nN/s),不管是單鍵還是多鍵相互作用,CD44-HA 相互作用斷裂力強度約在20～50 pN,相應的零力下負反應率分別約為0.3±0.5,0.57±0.11 s?1.不管是變異體CD44v或標準型CD44s,其與HA 相互作用的負反應率顯著低于其與P 選擇素、纖維蛋白或纖維蛋白原的相互作用,說明CD44-HA 相互作用更穩定.對于同樣表達CD44 的細胞,AFM 探針上直接包被HA 與探針上固定包被HA 的微珠的測量則表現出明顯差異.前者獲得的CD44-HA 相互作用的斷裂力范圍與底板直接包被CD44 或含CD44 的磷脂雙分子層的實驗體系基本可比,約為幾十皮牛.而探針上固定包被有HA 的微珠時,斷裂力則增加至nN 量級;這可能與細胞較軟,與微珠接觸面大,從而導致是多鍵相互作用有關.另外,比較不同分子量HA 與CD44 相互作用發現,高分子量HA 的斷裂力更低[67].從表2 統計也可以看出,二維條件下獲得的CD44?配體相互作用負反應率明顯高于三維條件下(表1)的結果,表明二維約束及外力作用對其反應動力學的調控作用.另外,針對CD44?選擇素、CD44-HA 相互作用體系而言,雖然已有研究報道了二維條件下的相互作用強度及零力下負反應率,但是負反應率隨外力的變化規律則鮮有報道.需要說明的是,考慮到不同實驗條件、實驗手段之間的差異,導致無法對測量結果進行直接比較,所以這里沒有將選擇素與PSGL-1 相互作用的結果統計在內.

表1 基于表面等離子共振技術的不同分子體系三維反應動力學參數比較Table 1 Comparison of three-dimensional interaction kinetic parameters for different molecular systems based on SPR technology

表2 基于原子力顯微鏡技術的不同分子體系的二維反應動力學參數比較Table 2 Comparison of two-dimensional interaction kinetic parameters for different molecular systems based on AFM technology

除了上述二維、三維條件下分子層次定量反應動力學測量,外力作用下CD44?配體相互作用介導的離體細胞層次粘附動力學也有系列報道,最典型的是模擬血流剪切的平板流動腔技術.已有研究表明,雖然生理條件下CD44 同為三種選擇素的配體[73-74],但是其結合強度不盡相同.流體剪切條件下,結腸癌細胞LS17T,T84 等來源的CD44v 與選擇素相互作用介導的微珠滾動速度表現為E 選擇素最慢,次之是P選擇素,而L 選擇素最快[75-76].另一方面,流體剪切條件下,表達有CD44 的白血病細胞株KG-1a 在HA包被的底板上呈現多相粘附特征:在約0.2 dyn/cm2下發生滾動粘附,而且滾動細胞數目隨著流體剪切的增加而增加,在0.7～1.0 dyn/cm2時滾動細胞數量達到最高,然后隨著流體剪切的進一步增加滾動細胞數量逐漸減少,抗剪切能力甚至可達100 dyn/cm2[77].造血祖細胞在包被HA 的底板上也存在類似現象,最優剪切力在1.0 dyn/cm2左右[78].此外,CD44 介導的人源膠質母細胞瘤的粘附和遷移速度取決于HA 水凝膠的硬度[79],表明CD44-HA 相互作用除受流體剪切外,同時受到硬度等力學微環境的調控.值得注意的是,CD44-HA 相互作用介導的細胞粘附動力學隨流體剪切呈現的多相特征與選擇素?PSGL-1 相互作用介導的細胞粘附動力學類似,而該特征是由外力作用下選擇素與PSGL-1 相互作用的逆鎖鍵特征決定的[80].不同流體剪切條件下白細胞滾動動力學改變的研究結果表明,外力可以將HA-CD44 相互作用從低親和力狀態轉變為高親和力狀態[81].而CD44?選擇素相互作用介導的細胞粘附動力學具有什么樣的特征？外力如何調控等問題,則鮮有報道.

2.3 高等數學的內容主要是微積分學，對學生來說，數學概念很抽象，比如數列極限的“ε-N”定義，函數極限的“ε-δ”定義等，數學定理的證明邏輯推理很嚴密，翻轉課堂的課前學習環節如果沒有教師的及時有效地引導，僅憑觀看視頻，不易準確把握視頻中的重難點，甚至不能聽懂授課內容，使學習效果不佳。

綜上所述,CD44 ?選擇素/HA 相互作用不論是在分子層次的反應動力學還是在細胞層次的粘附動力學,以及力學調控規律的研究還不完善.而CD44不同剪接體或糖基化修飾等的多樣性、HA 不同分子量大小或組裝方式,以及不同實驗條件、手段的差異等,導致現有數據之間難以進行直接比較,從而無法更好地闡釋其生物學功能.

4 CD44?配體相互作用的微觀結構基礎

結構決定功能,分子微觀結構特征決定了分子間相互作用反應動力學,進而決定細胞層次粘附動力學及其生物學功能.因此,明確CD44?配體相互作用的微觀結構特征有利于更好闡釋CD44?配體相互作用的差異以及在炎癥級聯反應過程中的作用.已有研究通過系列氨基酸位點突變實驗表明CD44 胞外氨基末端的球狀結構域(32～132 位氨基酸)是CD44 的配體—膠原蛋白,層粘連蛋白,纖連蛋白以及細胞表面受體(如E/L 選擇素)—的主要結合位點[82-83],且該結構域內的二硫鍵對于CD44 與HA 的結合也至關重要[84].此外,CD44 的胞外區有兩段高度保守的BX7B 多肽片段,其中一段為38～46 位氨基酸片段,參與其與HA 的結合(其中B 代表精氨酸Arg 或賴氨酸Lys,X7 代表任何7 個非酸性氨基酸).另一個BX7B 片段位于第一個片段“下游”約100 個氨基酸的位置,同樣可以與HA 作用[85].但是其微觀結構特征尚不清楚.

目前報道的原子層次精細結構主要包括CD44 N-末端的HABD(HA binding domain)結構域[86],以及HABD-HA 相互作用的復合物結構[87-88].通過比較HA 結合前后的構象變化,提出了CD44-HABD結構域存在兩種不同程度的變構效應:一是HA 結合導致HABD 結構域的Link domain C-末端擴展區的有序β9-sheet 變成高度無序的loop 區,并從Link domain 脫離,而且HABD 的C-末端片段在HA 結合狀態下柔性增加.根據該構象差異,將未結合狀態和HA 結合狀態下的HABD 構象分別稱為“有序(O)”和“部分無序(PD)”構象.超過90%的HABD 被認為在HA 結合狀態下采用PD 狀態,也就是說PD 構象具有更高的親和性[89].二是HA 的結合導致HABD上R45 位(人源蛋白對應于R41 位)精氨酸位點附近的loop 區發生取向變化,進而導致其與HA 結合能力的調整[88](圖1(a)和圖1(b)).CD44-HA 相互作用主要是靜電與范德華相互作用,雖然通過結構生物學手段獲得的復合物結構顯示HA 與HABD 的結合僅存在一種結合模式,而后續的分子模擬則預測HA與HABD 的結合可以存在3 種不同取向,分別是晶體結合模式,平行結合模式和直立結合模式,其中晶體結合模式結合能力最強,后兩個是亞穩狀態[90],體現出CD44-HA 相互作用的復雜性.

HA 的結合可誘導CD44 構象改變、進而調控其結合能力的觀點得到一系列研究的支持,并驗證了外力調控其相互作用的重要性.在此基礎上考察外力在CD44 介導的細胞(微珠)滾動中的作用,發現當HABD 通過C 末端標簽連接到微珠時,滾動行為僅在高剪切應力時才穩定發生,表明高剪切應力下HABD 從O 構象轉變到PD 構象,增強了其與HA 的相互作用,從而更好地抵抗流體剪切的作用.而采用O 構象或PD 構象的HABD 突變體包被的微珠則沒有上述隨流體剪切增高而粘附增強的現象.分子動力學模擬表明,作用于C 末端的外力可破壞C 末端區域和該結構域主體結構之間的相互作用,從而實現了從HABD 結構域從O 構象態到PD 構象態的變構;同時在C 末端施加的外力可更快地誘導高親和力PD 的構象、增強HABD-HA 相互作用,從而更有效介導白細胞的炎癥反應和造血祖細胞歸巢[81].此外,CD44-HA 相互作用介導的細胞粘附和遷移速度取決于HA 水凝膠的硬度,提示基于CD44 的信號傳導具有機械敏感性[79],進一步支持了力學因素調控CD44 不同親和態構象進而調控其與HA 的結合能力的觀點.

圖1 CD44?配體相互作用的微觀結構特征:(a)細胞粘附分子PSGL-1、CD44、E 選擇素與HA 的分布及相互作用網絡;(b)PSGL-1 的N 末端糖基sLeX 作用在E 選擇素Lectin 結構域的鈣離子附近;(c)HA 作用導致CD44 HABD 結構域發生構象改變Fig.1 Microstructural features of CD44?ligands interactions:(a)Schematic interaction network among PSGL-1,CD44,E-selectin and HA;(b)conformational allostery of CD44 HABD domain induced by HA binding;(c)crystalized E-selectin-sLeX interaction complex

雖然關于CD44 HABD 結構域及HABD-HA 相互作用的微觀結構特征有系列報道,但是CD44 其他結構域或不同糖基化的微觀結構特征及其對HA 結合的貢獻還不清楚.另外,盡管選擇素的微觀結構研究相對完善,包括構象動力學及其與配體PSGL-1 相互作用的特征[91-94](圖1(a)和圖1(b)),但是CD44 ?選擇素相互作用的微觀結構特征還尚無報道.因此,進一步從微觀結構層次考察CD44?選擇素相互作用特征及其力學調控規律,是深入理解其結構功能?關系的基礎.

5 CD44?配體相互作用介導的胞內信號通路

HA 是與CD44 結合進而通過胞內信號通路調控細胞遷移、生長與增殖等功能的主要配體之一.在調控細胞遷移方面:CD44 通過其胞內結構域與細胞骨架相關蛋白相互作用進而調控細胞遷移[95-96].ERM 是橋接CD44 與胞質肌動蛋白的主要蛋白之一[5],其結合位點位于CD44 胞質段的堿性氨基酸序列[97].HA 結合CD44 導致蛋白激酶C(PKC)激活,使得CD44 胞內端磷酸化,增強其與ERM 蛋白的結合,進而加強CD44 與細胞骨架的相互作用,促進細胞遷移[18,98-99].另外,HA 與CD44 的結合可以促進c-Src激酶募集至CD44 部位并激活c-Src,繼而增加細胞骨架蛋白cortactin 的酪氨酸磷酸化.Cortactin 的酪氨酸磷酸化減弱了其交聯絲狀肌動蛋白的能力,從而調節細胞的遷移能力,促進細胞的募集[100].HA 與CD44相互作用還可以激活Rho GTPase(如Cdc42,Rac1 等)信號,該信號通過不同的效應分子來調控細胞骨架的重組,進而調控細胞遷移.HA-CD44 相互作用可以通過Cdc42 調節F 肌動蛋白進而調節細胞骨架,促進細胞的募集[101];HA 與某些表達CD44 的細胞結合也可激活Rac1 信號傳導,進而調控細胞膜皺褶結構或細胞運動.CD44v3 與Tiam1 之間的相互作用促進了Rac1 信號轉導和細胞骨架介導的乳腺腫瘤遷移[102].HA 的結合促進CD44 與癌蛋白Vav 家族成員Vav2 蛋白的相互作用,維持Rac1 和Ras 活化,促進卵巢腫瘤細胞生長和遷移增加[103](圖2(a)).另外,HA與CD44 相互作用還可通過不同信號通路調控細胞的生長、增殖、存活等.CD44-HA 相互作用可通過Rho 激活誘導PI3K,再由PI3K 激活絲氨酸/蘇氨酸激酶(Akt),進而促進細胞增殖和存活[104].同時,CD44還通過HA 合成酶HAS2,HA 及Akt 信號通路之間的正反饋回路誘導乳腺癌細胞中Akt 信號的持續激活,最終克服凋亡并維持細胞存活[105].外源性HA 通過骨髓巨噬細胞樣細胞上兩種不同的HA 受體增強造血功能.其中一種是HA?CD44 與激活p38 絲裂原活化蛋白(MAP)激酶的途徑相關,CD44-HA 增強了細胞的增殖[106].HA?CD44 相互作用還可通過細胞外信號相關激酶1 和2(ERK1/2)介導內皮細胞的活化和增殖[107];或通過激活ERK2,進一步磷酸化Elk-1,促進細胞遷移以及增殖[101].CD44 也可以作為共同受體而行使生物學功能,通過與肝細胞生長因子HGF 結合,CD44v6 與Met 以及HGF 形成三體復合物并促進Met 激活,去除CD44 胞質尾部依舊可以激活Met,但需有CD44 胞質尾部與ERM 蛋白相互作用、才能激活Ras-MAPK 途徑[108].CD44v6-ECM 結合還促進PI3K/Akt 途徑激活和Met 轉錄[109-110].

圖2 介導細胞粘附與遷移的CD44 胞內信號通路:(a)HA 與CD44 相互作用啟動的CD44 胞內信號通路;(b)E 選擇素與CD44 相互作用啟動的CD44 胞內信號通路Fig.2 CD44?mediated intracellular signaling pathways for cell adhesion and migration:(a)CD44-HA interaction mediated intracellular signaling pathways;(b)CD44?E-selectin interaction mediated intracellular signaling pathways

另一蛋白Merlin 在CD44 胞內端的結合位點與ERM 存在競爭性作用,Merlin 的激活發生在ERM 蛋白失活之后.Merlin 的激活引起皮質肌動蛋白細胞骨架的重組,同時阻止Ras 激活以及Ras 依賴性信號轉導,并抑制了多種受體酪氨酸激酶的信號傳遞[5].絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PAK2 可使Merlin 磷酸化[111],但同時導致Merlin 失活并抑制其與CD44 的結合[99].高細胞密度或高分子量HA 的加入會觸發Merlin 的去磷酸化,從而導致生長抑制復合物的形成,使得細胞增殖受限[5].因此,ERM 蛋白和Merlin 蛋白具有控制細胞增殖的“開關”作用.

除上述HA 結合啟動CD44 胞內信號通路在細胞生長、增殖、細胞骨架重組等過程中的作用外,CD44 作為細胞粘附分子則呈現出不同的信號通路.從現象上來講,CD44-HA 相互作用介導的T 細胞外滲同時依賴于整合素VLA-4 與配體VACM-1 相互作用[112],而CD44 胞內端缺失則破壞了VLA-4 整合素介導的T 細胞穩定粘附和外滲[113],提示CD44 可能通過胞內某種信號通路與VLA-4 整合素協同作用.CD44-HA 相互作用也可增加整合素信號傳導,從而導致細胞鋪展[114].高表達CD44 的結腸癌細胞通過CD44 交聯或低分子量HA 刺激可誘導β2整合素αLβ2的表達,并進一步通過αLβ2-ICAM-1 相互作用促進癌細胞在內皮細胞上的粘附和跨內皮遷移,通過加入PKC 酶抑制劑,可阻斷該過程的發生[115].類似地,CD44 交聯導致MDA-MB-435S 或Hs578T 乳腺癌細胞系上整合素αLβ2與VLA-4 表達上調,并進一步通過整合素?配體相互作用促進乳腺癌細胞跨內皮遷移[116](圖2(a)).E 選擇素結合也可觸發CD44 胞內信號、從而激活整合素.E 選擇素與CD44 相互作用可以介導中性粒細胞的慢速滾動過程,其原因在于E 選擇素的結合可通過脂筏上CD44 胞內端SFK →Syk →Btk →p38 的信號通路激活整合素αLβ2,進而通過αLβ2-ICAM-1 相互作用促進細胞的慢速滾動[31](圖2(b)).

正常生理條件下CD44 成簇定位于細胞膜脂筏上,因此脂筏的破壞與否對其與配體相互作用的能力、胞內信號的傳遞及相應生物學功能有明顯調控作用.通過甲基-β-環糊精(MβCD)消耗膜膽固醇、降低CD44 在脂筏中的聚集,可增強T 細胞上CD44與HA 的結合,進而增加了生理流動條件下T 細胞發生滾動粘附的細胞數量[117].而高水平的膽固醇促進CD44 進入脂筏,CD44-Ezrin 結合力減弱,抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲[118].另外,多數Src 家族激酶可被特定的脂質修飾,而這些脂質可以將Src 激酶引導至具有高膽固醇和糖磷脂含量的脂筏區域.因此,CD44與脂筏中的c-Src 激酶直接結合可促進HA 介導的c-Src 激酶活性并介導細胞骨架調節的細胞遷移[119].高分子量HA 可以加強CD44 成簇,而HA 片段似乎沒有作用[120-121].有趣的是,寡糖HA 孵育細胞后,能夠減少先前由高分子量HA 誘導形成的CD44 簇[122].

簡言之,CD44 通過復雜的胞內信號網絡介導細胞的生長、增殖、遷移等多種生物學過程,而且受到力學、CD44 糖修飾、CD44 簇集及不同配體作用等多種因素調控.作為細胞粘附分子,HA 或E 選擇素的結合均可通過CD44 胞內信號通路激活整合素,進而通過整合素?配體相互作用實現免疫細胞募集、癌細胞遷移等過程的級聯反應.需要說明的是,就目前的報道可以發現,HA 與CD44 相互作用主要是激活T 淋巴細胞或癌細胞上整合素的表達上調,進而通過增強整合素?配體相互作用的親和力(avidity),促進細胞間粘附或跨膜遷移;而E 選擇素與CD44 相互作用則主要是激活中性粒細胞上整合素構象的改變,進而通過增強整合素配體相互作用的親和性(affinity),促進細胞間的粘附或跨膜遷移,從而表明不同配體與CD44 相互作用介導不同的生物學功能.作為在肝臟免疫中起重要作用的分子體系,HA 與CD44 相互作用如何調控中性粒細胞在肝血竇內的募集,其與整合素之間存在怎樣的協同作用等問題尚不清楚.

6 結論與展望

作為干細胞鑒定或疾病檢測、病程發生發展的標志物,胞內多種復雜信號網絡的觸發分子,以及介導細胞粘附的重要受體,CD44 分子的生物學重要性毋庸置疑,其相應內在機制的研究也日趨深入.隨著人們對生命活動規律及內在機制認知的加深,研究者們逐漸認識到力學、物理因素對生命活動的不可或缺性,重要研究進展包括力學因素對發育[123-127]、遺傳[128]、免疫[129]等重要生命活動的調控,并催生了力學醫學、力學免疫學、力學組學新概念,發展了生物力學與力學生物學等交叉研究領域,但是其內在機制還遠不清楚.如上所述,CD44 作為細胞膜表達分子,其與配體HA 或選擇素相互作用介導的細胞粘附受到生理力學、物理微環境的調控,包括流體剪切、基質硬度等.

雖然目前關于CD44 與配體相互作用微觀結構特征、分子反應動力學、細胞粘附動力學及胞內信號通路均有報道,但是力學因素調控CD44 與配體相互作用的規律及內在機制還遠不清楚,均需深入研究.在不同力學因素對細胞粘附動力學的調控規律及內在機制方面:主要包括外力作用下CD44 與選擇素相互作用介導的細胞粘附動力學具有什么樣的特征;外力作用下不同分子量膜定位的HA 與CD44相互作用介導的細胞粘附動力學差異;其不同組裝形式對細胞粘附的調控等.在分子相互作用反應動力學的調控規律及結構基礎方面:主要包括分子層次CD44 與選擇素/HA 相互作用的力學調控規律,及相互間的差異;不同分子量HA-CD44 相互作用的力學調控規律,及其組裝方式的影響;原子層次CD44與選擇素相互作用特征及其力學調控特征等.特別地,作為肝臟免疫過程中起重要作用的分子體系,尚待考察的問題包括其獨特力學、物理微環境如何調控CD44 與HA 相互作用介導的細胞粘附動力學？其生物學功能如何體現其組織特異性等.