鴨疫里氏桿菌OmpA基因真核表達載體構建及免疫效果初步評價

余波，李婷，徐景峨，張亞楠，姜玲玲，周思旋，卜仕金

(1. 揚州大學獸醫學院/江蘇省動物重要疫病與人畜共患病防控協同創新中心，江蘇 揚州 225009；2. 貴州省農科院畜牧獸醫研究所，貴州 貴陽 550005)

鴨疫里氏桿菌病是由鴨疫里氏桿菌(Riemerellaanatipestifer，RA)感染引起的一種急性、敗血性傳染病[1]。鴨、鵝等水禽易通過呼吸道和皮膚傷口途徑感染，該細菌通過侵入血液，產生毒素，造成組織器官損傷。細菌的莢膜還能侵染幼齡動物的腦組織，引起神經性癥狀。RA主要導致的病變特征為肝周炎、氣囊炎和纖維素性心包炎，統稱為“三炎”，還伴有干酪性輸卵管炎、關節炎和腦膜炎等[2-3]。引起雛鴨的發病率和死亡率高，嚴重危害水禽養殖業的發展[4]。

RA血清型多且各血清型之間缺乏交叉保護，使得不同地區、同一地區的不同時段存在多種血清型或亞型的混合感染[5-6]。目前主要通過地區流行的優勢血清型分離株所研制的滅活疫苗來防控RA感染。由于臨床長期使用抗生素，致使RA易產生多重耐藥性，給該病的防治帶來很大困難[7]。鑒于處膜蛋白A(OmpA)在分離的RA菌株間具有高度保守性，不同血清型菌株OmpA蛋白之間存在交叉免疫原性，可制成一種針對多血清型的RA疫苗[8]。本研究旨在構建OmpA真核表達質粒，同時驗證其在DF-1細胞中的表達及其對雛鴨的免疫保護效果，為進一步開發和研制RA新型基因工程疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試劑

陽性質粒pUC57-OmpA由上海生工生物公司構建；pVAX1真核表達載體由貴州大學動物科學學院鮮思美老師饋贈；DF-1細胞購自豐暉生物公司；DNA膠回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒購自OMEGA；DNA Ligation Kit、DNA Marker Ⅲ、DNA限制性內切酶XhoⅠ和BamHⅠ購自TaKaRa；大腸桿菌DH5α、DL2000、HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒、無內毒素質粒提取試劑盒均購自天根生化科技；羊抗兔IgG-FITC購自北京博奧森公司。鴨傳染性漿膜炎三價滅活疫苗(1型ZJ01株+2型HN01株+7型YC03株)購自齊魯動物保健品有限公司。HRP標記羊抗鴨IgG購自美國KPL公司。RA抗體陰性雛鴨購自貴州千里山生態食品股份有限公司種鴨場。

1.1.2 兔抗OmpA原核重組蛋白多抗血清的制備

將RAompA基因構建入pET32a+原核表達載體，將重組表達質粒pET32a+-RA -OmpA轉化感受態細胞BL21 (DE3)進行誘導表達，IPTG 誘導蛋白表達后，經 12% SDS-PAGE 分析，目標蛋白主要存在于沉淀中為包涵體，將重組蛋白尿素溶液裝入透析袋中進行復性，Ni+柱親和純化重組蛋白，將純化好的重組蛋白與弗氏完全佐劑混合，免疫3只新西蘭白兔(2～2.5 kg)，皮下免疫0.5 mg/次，以后每間隔14 d加強免疫1次，加強免疫使用弗氏不完全佐劑乳化重組蛋白。通過間接ELISA方法檢測抗血清對PA OPMA重組蛋白的效價，結果3免后，效價為1∶12 800，采血分離血清制備成多抗血清。

1.2 引物設計及合成

根據GenBank中ompA基因序列，結合pVAX1真核表達載體多克隆位點，利用Primer premier 5.0設計ompA基因的特異性引物。選用XhoⅠ和BamHⅠ作為酶切位點，引物由上海生工生物公司合成，上游引物：5′-GGATCCATGTTGATGACTGGACTTGGT-3′，下劃線為XhoⅠ酶識別位點；下游引物：5′-CTCGAGTTATTTTCTTTTCTTTTTTACTACT-3′，下劃線為BamHⅠ酶識別位點。

1.3 ompA基因真核表達質粒的構建

將陽性質粒pUC57-OmpA及載體質粒pVAX-1分別經限制性內切酶XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切，連接后轉化DH5α感受態細胞，涂布于含卡那霉素抗性LB平板，37 ℃培養過夜，從轉化的卡那霉素 LB平板上挑選單個白色菌落，接種至含卡那霉素的LB液體培養基中培養過夜。采用小量質粒提取試劑盒提取質粒，進行雙酶切鑒定，同時以提取重組質粒進行PCR鑒定，將質粒送往上海生工生物有限公司進行序列測定。

1.4 ompA基因真核表達質粒轉染DF-1細胞

1.4.1 無內毒素質粒的提取

使用無內毒素質粒提取試劑盒，抽提經鑒定正確的真核表達質粒pVAX1-OmpA和空載體質粒pVAX1測定濃度及純度，選擇OD260與OD280比值為1.8～2.0對應的質粒。

1.4.2 質粒轉染DF-1細胞

將DF-1細胞接種于6孔細胞培養板中，用含10%胎牛血清的DMEM營養液培養細胞長至80%～100%單層時，棄掉上清，PBS緩沖液清洗2～3次，按脂質體轉染試劑說明書，將重組質粒pVAX1-OmpA和空質粒pVAX1分別轉染DF-1細胞，空白組不作任何處理。37 ℃，5% CO2培養箱中培養5 h后更換新的含有5%胎牛血清的DMEM培養液繼續培養至48 h。

1.5 RT-PCR方法檢測ompA基因在DF-1細胞中的轉錄

采用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，參照HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒說明書，進行cDNA合成。以cDNA為模板，進行PCR 擴增。PCR反應體系為25 μL，取2×PCR MiX 12.5 μL，模板2 μL，上、下游引物(10 mol/μL)各1 μL，ddH2O補至25 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性45 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。取6 μL PCR產物于含核酸染料(Gold View)的1.2%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

1.6 間接免疫熒光(IFA)檢測ompA基因表達

收集轉染后48 h的DF-1細胞，用預冷PBS洗3遍；加入4%多聚甲醛室溫固定20 min，棄去固定液，用預冷PBS洗3遍；加入0.3% TritonX-100室溫透化20 min，棄去TritonX-100，用預冷PBS洗3遍；加入一抗(兔抗ompA原核表達蛋白血清)，37 ℃孵育1 h，棄去一抗，用預冷PBS洗3遍；加入二抗(FITC標記的羊抗兔IgG)，37 ℃孵育1 h，棄去二抗，用預冷PBS洗3遍；加入細胞核染料DAPI，室溫作用4 min，用預冷PBS洗3遍；于熒光顯微鏡下觀察結果。

1.7 Western blot檢測重組蛋白的表達

收集轉染后48 h的DF-1細胞進行裂解，12% SDS-PAGE后，轉印至PVDF膜，以兔抗OmpA原核表達蛋白血清(1∶500)為一抗，羊抗兔 HRP-IgG(1∶2 000)為二抗，采用ECL顯色。

1.8 pVAX1-OmpA DNA疫苗的免疫保護試驗

采用無內毒素質粒大提試劑盒提取重組質粒pVAX1-OmpA和pVAX1空質粒，并測定核酸濃度。將1日齡RA抗體陰性健康雛鴨120只飼養至10日齡以適應環境，將其隨機分成4組，30只/組，分別為100 μg/只pVAX1-OmpA質粒免疫組、100 μg/只pVAX1質?？瞻讓φ战M、0.2 mL滅活疫苗對照組、0.2 mL生理鹽水對照組。采用頸部皮下免疫接種，免疫7 d后對雛鴨進行二次免疫。首免疫后7、14、21、28、49、63 d，隨機抽取各組10只雛鴨，采血分離血清。

采用間接ELISA檢測雛鴨RA抗體，ELISA板每孔包被5 μg OmpA原核表達蛋白，雛鴨血清1∶100稀釋，37 ℃孵育1 h，PBS洗3次，加入HRP標記羊抗鴨IgG(1∶2 000)，37 ℃孵育45 min，PBS洗滌3次，TMB室溫顯色15 min，2 mol/L硫酸終止反應，測定OD450值。

攻毒保護試驗，對二免后14 d的試驗鴨，每組隨機抽出10只，采用菌液濃度為4×107CFU/mL(2倍LD50劑量) 1型RA菌懸液菌珠編號為GZSH001，來源于貴州三穗縣鴨場，使用RA分型血清鑒定為RA1型、通過腿部肌肉注射接種測定攻毒保護率，觀察記錄攻毒后1周內的發病或死亡情況。

2 結果

2.1 ompA基因真核表達質粒的構建

通過質粒PCR(圖1)、雙酶切(圖2)及測序鑒定，結果表明ompA基因與pVAX1載體連接正確，ompA基因片段大小約為1 149 bp，將雙酶切與測序結果鑒定為陽性的重組真核表達質粒，命名為pVAX1-ompA。

M. DL2000；1～2. pVAX1-OmpA；3. 陰性對照

M. DL5000；1. pVAX1-OmpA；2. pVAX1-OmpA雙酶切

2.2 RT-PCR檢測真核表達質粒瞬時表達結果

真核表達質粒pVAX1-OmpA和pVAX1轉染DF-1細胞48 h后，提取細胞總RNA，通過RT-PCR方法檢測到目的基因表達，見圖3。

M. DNA Marker D2000;1. pVAX1-OmpA;2. pVAX1，3. 正常細胞對照

2.3 IFA檢測真核表達質粒瞬時表達

IFA檢測結果顯示，真核表達質粒pVAX1-OmpA轉染DF-1細胞48 h后，胞漿可見綠色熒光(圖4A)；pVAX1轉染組未見綠色熒光，顯示觀察視野為黑色(圖4B)。

圖4 重組質粒轉染DF-1細胞后IFA檢測結果

2.4 Western blot檢測重組蛋白的表達

重組質粒pVAX1-OmpA轉染DF-1細胞后48 h，收集細胞裂解后進行Western blot，結果顯示細胞轉染重組質粒在41 kDa左右出現條帶，與預測結果大小一致，而空載體未出現該條帶，見圖5。

M. 蛋白Marker；1. pVAX1-OmpA轉染DF-1細胞；2. pVAX1空載體轉染DF-1細胞

2.5 pVAX1-OmpA DNA疫苗對雛鴨感染RA的保護試驗

以100 μg/只重組質粒pVAX1-OmpA采用頸部皮下免疫接種，免疫7 d后對雛鴨進行二次免疫，用間接ELISA法檢測免疫后RA抗體水平。結果，重組質粒pVAX1-OmpA試驗組于7 d、21 d極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)低于滅活疫苗對照組，而14、28、35、49、63 d差異不顯著，見圖6。

攻毒后7 d內的發病或死亡情況結果顯示，重組質粒pVAX1-OmpA試驗組21 d保護率達100%，滅活疫苗對照組21 d保護率達90%，pVAX1空載體對照和生理鹽水對照組21 d保護率均為10%，見圖7。

圖6 不同免疫組抗體動態變化

圖7 雛鴨21 d攻毒保護試驗結果

3 討論

目前國內外學者均致力于研究出一種對各血清型RA均有保護作用的新型有效疫苗，其中DNA疫苗是較為理想的發展方向。DNA疫苗不僅可同時誘導體液與細胞免疫應答，產生持久性免疫應答，還能交叉保護不同血清型，具有易生產，穩定性強，貯存、運輸方便等優點[9]。DNA疫苗研制的關鍵在于靶基因序列與表達載體的選擇，選擇一種或幾種具有交叉保護性的抗原成分能提供更全面的保護[10]。OmpA作為RA的主要外膜蛋白，其基因序列高度保守，具有良好的免疫原性，不僅能激發特異性體液免疫和細胞毒性反應，輔助其他抗原交叉提呈，提高機體的免疫應答水平，且能對不同血清型RA起到免疫交叉保護的作用，是RA核酸疫苗研制的首選靶基因[11]。雷云[12]成功構建了ompA基因真核表達質粒pcDNA3.1(+)-OmpA，免疫雛鴨后證實該真核表達質粒能刺激鴨體內產生RA特異性抗體，對血清1型和2型RA均有一定的免疫保護作用。

真核表達質粒誘發機體產生的免疫效果與質粒載體表達抗原蛋白的能力呈正相關，因此構建DNA疫苗還應選擇高效的質粒表達載體[13]。pVAX1作為哺乳動物細胞表達系統中高效表達目的基因的表達載體，大小為3.0 kb，是基于pcDNA3.1上重建得到的新型真核表達載體，用卡那抗性代替安芐抗性篩選基因，能有效降低人類基因組重組的可能，且pVAX1載體為非融合載體，其產生的蛋白在結構和功能上與天然存在的蛋白質幾乎相同[14]。由于具有BGH poly A信號和強大的人巨細胞病毒啟動子(CMV)，表達容量大，分子量小等優點，pVAX1作為真核表達載體已用于構建多種傳染病或寄生蟲病的重組核酸疫苗[15]。龔麗貞等[16]構建了重組質粒pVAX1-Cal-SAG1和pVAX1-SAG1，免疫小鼠后，通過ELISA、CCK-8法和小鼠攻蟲試驗證明該DNA疫苗能夠誘導小鼠機體產生體液和細胞免疫。張真等[17]構建重組質粒pVAX1-Hsp65-Ag85B和PVAX1-Hsp65-ESAT6，經體外轉染驗證其表達后，免疫小鼠證實均可激發較強的免疫反應。

本研究選擇pVAX1作為真核表達載體，成功構建了ompA基因的真核表達質粒pVAX1-OmpA，通過脂質體轉染至DF-1細胞，采用RT-PCR、IFA、Western blot試驗證實了真核表達質粒pVAX1-OmpA能在DF-1細胞中瞬時表達。同時IFA試驗中pVAX1-OmpA真核表達蛋白能夠被OmpA基因原核表達蛋白免疫兔得到的多抗所識別，結合羊抗兔IgG-FITC，在細胞胞漿顯示出綠色熒光，Western blot結果也顯示重組質粒轉染細胞后在41 kDa左右出現條帶，表明該真核表達蛋白成功表達。對雛鴨感染RA的保護試驗中，重組質粒pVAX1-OmpA組誘導體液免疫水平在28 d后與滅活疫苗組相當，而攻毒試驗結果表明重組質粒pVAX1-OmpA組免疫21 d后可為雛鴨提供高于滅活疫苗組的免疫保護效果，這可能與該DNA疫苗同時產生細胞免疫有關。在后續研究中，需要測定細胞免疫水平，以研究其體液免疫和細胞免疫與RA攻毒保護率的相關性，以及探討聯合應用免疫增強劑以提高其體液免疫水平，以期能更好地對候選重組DNA疫苗進行全面的免疫效果評價。