正交試驗法優化南非葉抑菌活性成分提取工藝

黃敏桃 龐小莉 楊林芳 譚麗鳳 薛娟萍 廖顯輝 黃庶識

摘 要 利用正交試驗法，以南非葉對金黃色葡萄球菌的抑菌活性為指標，采用超聲波提取法對南非葉提取工藝進行優化。在單因素試驗基礎上，選擇試驗因素和水平，設計正交試驗考察南非葉抑菌活性成分最佳提取工藝。結果表明，最佳提取工藝為：95%乙醇超聲提取2次，提取時間60 min，液料比30∶1（體積與重量比）。在此條件下提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達18.08 mm。

關鍵詞 南非葉;抑菌;活性成分;提取工藝;正交試驗法

中圖分類號：Q503 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2021.34.018

南非葉為菊科斑鳩菊屬植物扁桃斑鳩菊（Vernonia amygdalina Del.）的葉。扁桃斑鳩菊別名桃葉斑鳩菊、神奇葉、苦樹、苦膽葉、苦茶葉、南非樹等[1]，原產于熱帶非洲，在尼日利亞等地被當作一種蔬菜[2]，尤以東南亞和臺灣等地民間應用較多，已在藥品、食品工業等領域得到應用。南非葉味苦澀，性涼，具有抗腫瘤、抗氧化、清熱解毒、散熱涼血、降血壓、降膽固醇和降血糖等多種功效[3-5]，適用于高血壓、高膽固醇、糖尿病的治療。南非葉的水煎劑具有促胃酸分泌、降血脂、抗瘧原蟲和抗癌作用[6]。東南亞民間常用南非葉治療乳腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肺癌、結腸癌等多種癌癥[7-8]。因此，南非葉以抗癌草藥著稱。

前人研究表明，南非葉的熱乙醇或冷乙醇提取物可以抑制金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、傷寒桿菌的生長[9]，表明南非葉具有較強的抗菌活性。南非葉在我國廣東、廣西、福建等地均有引進種植，是民間常用中藥，但是相關文獻還未見涉及其抑菌活性研究。筆者以廣西南非葉為研究對象，采用對金黃色葡萄球菌的抑菌效果作為指標，在單因素試驗的基礎上，應用正交試驗法對南非葉提取工藝進行優化研究，為后續南非葉品質研究提供參考依據。

1? 材料與方法

1.1? 試劑與材料

1.1.1? 藥材與試劑

藥材：南非葉購于廣西玉林中藥材專業市場。

試劑：石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、95%乙醇（均為分析純，天津大茂化學試劑廠生產），純化水。

1.1.2? 細菌

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus Rosenbach ）（ATCC26003）購自美國模式培養物集存庫（American Type Culture Collection）。

1.1.3? 培養基

瓊脂培養基、營養肉湯（廣東環凱公司生產）。

1.2? 設備

電子天平（浙江永康市五鑫衡器有限公司），數顯恒溫水浴鍋（北京中興偉業儀器有限公司），索氏提取器（上海精學科學儀器有限公司），數顯電熱培養箱（上海博迅實業有限公司），牛津杯（天津思利達公司），0.22 μm微孔濾膜（天津津騰公司），超凈工作臺（蘇州凈化設備廠），智能型超聲波清洗機（福州德森精工有限公司）。

1.3? 試驗方法

1.3.1? 不同溶劑提取試驗

稱取5 g南非葉粉末6份，分別加入石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、95%乙醇、純化水各150 mL，超聲波提取60 min，提取2次，過濾濃縮揮干，揮干物用甲醇定容至10 mL容量瓶備用。重復3次。

1.3.2? 提取方法試驗

稱取5 g南非葉粉末3份，各加入95%乙醇150 mL，一份超聲波提取2 h，一份常溫浸泡24 h，一份于95 ℃索氏回流提取2 h，過濾濃縮揮干，揮干物用甲醇定容至10 mL容量瓶備用。重復3次。

1.3.3? 提取功率試驗

稱取5 g南非葉粉末2份，各加入95%乙醇150 mL，分別選擇20、40 kHz兩個超聲功率提取60 min，提取2次，過濾濃縮揮干，揮干物用甲醇定容至10 mL容量瓶備用。重復3次。

1.3.4? 液料比試驗

稱取5 g南非葉粉末6份，分別加入50、100、150、200、250、300 mL的95%乙醇溶劑，20 kHz超聲波提取1 h，提取2次，過濾濃縮揮干，揮干物用甲醇定容至10 mL容量瓶備用。重復3次。

1.3.5? 提取時間試驗

稱取5 g南非葉粉末5份，各加入150 mL的95%乙醇溶劑，20 kHz超聲波分別提取30、40、50、60、70 min，提取2次，過濾濃縮揮干，揮干物用甲醇定容至10 mL容量瓶備用。重復3次。

1.3.6? 提取次數試驗

稱取5 g南非葉粉末4份，各加入150 mL的95%乙醇溶劑，20 kHz超聲波分別提取1、2、3、4次，過濾濃縮揮干，揮干物用甲醇定容至10 mL容量瓶備用。重復3次。

1.3.7? 杯碟法測定樣品對細菌生長的抑制作用

將金黃色葡萄球菌接種至營養肉湯，35 ℃恒溫培養15～18 h至生長對數期，用無菌生理鹽水稀釋10倍，將稀釋后的菌液吸取50 ?L均勻涂布在瓊脂平板表面，稍干后將牛津杯等距離放置瓊脂表面，一個平板放置3個牛津杯，每個牛津杯定量加入200 ?L無菌過濾后的南非葉提取液，4 ℃冰箱放置10 h使藥液擴散，再移到35 ℃恒溫箱繼續培養18～20 h，觀察并測量抑菌圈直徑。每個藥液樣品試驗重復3次，其平均值為抑菌結果。

1.3.8? 正交試驗法對提取工藝的優化

綜合各單因素試驗結果設計正交試驗條件，以南非葉抑菌圈為指標，提取時間（50 min、60 min、70 min），液料比（20∶1、30∶1、40∶1，皆為體積與重量比，下同），提取次數（1次、2次、3次）為考察對象（見表1），重復試驗3次。

2? 結果與分析

2.1? 單因素試驗

2.1.1? 不同溶劑提取試驗

試驗表明，石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、95%乙醇、甲醇和水六個處理的抑菌圈直徑分別為6、13.62、12.72、13.29、6、6 mm，可見石油醚、甲醇、水這3種試劑對金黃色葡萄球菌無明顯對抑菌作用，正丁醇、95%乙醇提取物抑菌效果最好，其次為乙酸乙酯提取物。從試劑安全性及經濟方面綜合考慮，95%乙醇作為提取溶劑，既能達到最佳抑菌效果，且安全無污染，節約成本，因此，最后選擇95%乙醇作為提取溶劑，與Ogbulie J N等[9]研究結果一致。

2.1.2? 提取方法試驗

通過超聲波、冷浸、索氏回流3種方法提取的提取物對金黃色葡萄球菌的抑制作用差異較大，回流提取與超聲波提取時間均為2 h，冷浸時間較長，抑菌效果順序為超聲波（13.29 mm）>索氏回流（9.73 mm）>冷浸（6 mm）?？赡艿脑蚴?，超聲波在快速振蕩情況下，其空化作用對細胞膜起到破壞從而有助于有效成分溶出釋放，避免有效成分因受熱引起破壞。而回流提取通過加熱促使有效成分溶出，因此比冷浸提取抑菌效果好，但是可能由于溫度過高，部分成分被破壞，抑菌效果整體比超聲波低。超聲波提取法作為常見的一種提取方法，操作簡便，成本較低。前人研究表明，超聲波對南非葉總黃酮、多酚等成分具有良好的提取效果[10-11]，而總黃酮類化合物具有明顯抑菌作用。因此，后續的南非葉提取方法研究選擇超聲波提取法。

2.1.3? 提取功率試驗

20 kHz條件下南非葉提取物抑菌活性較好，40 kHz情況下也具有抑菌效果，20 kHz、40 kHz功率的抑菌圈直徑分別為15.15、13.31 mm。超聲波功率越高，在提取過程中會不斷產生熱量，溫度提高，可能對部分成分產生破壞，影響效果。因此選擇提取功率為20 kHz。

2.1.4? 液料比試驗

由圖1可知，液料比30∶1的提取效率最高，抑菌圈達到17.53 mm。95%乙醇量繼續增加，反而抑菌效果減弱，可能存在試驗誤差等客觀因素。綜合考慮節約溶劑等，采用30∶1的液料比進行優化試驗。

2.1.5? 提取時間試驗

由圖2可知，隨著時間增加，整體上南非葉提取物抑菌活性增強，在40 min時有下降趨勢，可能存在試驗誤差，50～70 min時間內呈緩慢上升趨勢，三個時間段抑菌效果相差不明顯，抑菌圈直徑相差僅約0.3 mm，結合相關南非葉提取時間約60 min研究結果 [11]，考慮節約時間成本，認為提取時間為60 min較合適。

2.1.6? 提取次數試驗

試驗表明，提取次數1、2、3、4次的抑菌圈直徑分別為14.69、17.52、17.68、17.58 mm。綜合考慮成本等因素，以提取2次的抑菌效果最好，提取次數增加，抑菌效果增加不明顯。因此，采用提取2次進行試驗優化。

2.2? 正交試驗

表2結果顯示，對南非葉提取物抑菌效果的影響順序為提取時間（A）>液料比（B）>提取次數（C）。方差分析結果（見表3）表明，提取時間影響效果更加顯著，另外兩個因素影響相對較小。根據正交試驗結果，確定A2B2C2為最佳提取條件，即提取時間60 min，液料比30∶1，提取次數2次。

2.3? 驗證試驗

采用超聲波提取法，以95%乙醇為提取溶劑，提取時間60 min，液料比30∶1，提取2次，此條件下進行試驗驗證（見表4）。結果表明，正交試驗法優化得到的南非葉提取物對金黃色葡萄球菌抑菌效果穩定。

3? 結論與討論

超聲波提取方法簡便、耗時短、效率高，能夠使南非葉粉末在高頻率振蕩過程中充分溶解出有效活性成分，同時避免因高溫加熱而引起部分活性成分被破壞失效等問題，是一種理想的常用提取方法。根據研究結果，南非葉提取物對金黃色葡萄球菌抑菌活性成分最佳提取工藝為：95%乙醇超聲波提取2次，提取時間60 min，液料比30∶1（體積與重量比），在此條件下抑菌圈直徑為18.08 mm，RSD值為0.64%，說明提取工藝條件穩定、可行，可為后續進一步研究提供參考。

參考文獻：

[1] 管磬馨，胡文忠，張 越，等.南非葉活性成分及抗癌功效的研究進展A].中國食品科學技術學會第十六屆年會暨第十屆中美食品業高層論壇摘要集[C]，武漢，2019：243-244.

[2] Tonukari NJ，Avwioroko OJ，Ezedom T，et al. Effect of Preservation on Two Different Varieties of Vernonia amygdalina Del.（Bitter） Leaves[J]. Food and Nutrition Sciences，2015（7）：633-642.

[3] 張梅坤.南非葉扦插繁殖技術試驗[J].防護林科技，2015（8）：33-35.

[4] 楊早.南非葉化學成分及藥理作用研究進展[J].南京中醫藥大學學報，2013（4）：397-400.

[5] Sani AA，Alemika ET，Abdulraheem RO，et a1. A study review of documented phytochemistry of Vernonia amygdalina（family Asteraceae） as the basis for pharmacologic activity of plant extract[J]. Journal of Natural Sciences Research，2012（7）：1-8.

[6] 章健.辛溫與苦寒藥配伍規律初探[J].安徽中醫學院學報，1988，7（3）：43-45

[7] Izevbigie EB，Bryant JL，Walker A. A novel natural in hibitor of Extracellular signal-regulated kinases and human breast cancer cell growth[J]. Exp Biol Med （Maywood）. 2004，229（2）：163-169.

[8] 李盛青，黃兆勝，劉明平.五味與五臟歸經關系探討[J].中醫研究，2010，10（5）：5-7.

[9] Ogbulie JN，Ogueke CC，Nwanebu FC. Antibacterial properties of Uvaria chamae， Congronema latifolium， Garcinia kola， Vemonia amygdalina and Aframomium melegueta[J]. African Journal of Biotechnology，2007，6（13）：1549-1553.

[10] 陳文娟，韓穎，陳建福.超聲波輔助法提取南非葉多酚的工藝研究[J].云南民族大學學報（自然科學版），2020，29（5）：423-429.

[11] 雷燕妮，張小斌，陳書存，等.南非葉中總黃酮提取工藝的優化[J].陜西農業科學，2021，67（4）：54-57，62.

（責任編輯：丁志祥）

收稿日期：2021-08-12

基金項目：廣西高校中青年教師基礎能力提升項目（2019KY1415）;廣西教育廳科技項目“廣西職業教育林業技術專業（群）發展研究基地”（桂教職成〔2019〕63號）;廣西科學研究與技術開發計劃（0992003A-20）。

作者簡介：黃敏桃（1987—），女，廣西南寧人，碩士，講師，主要從事中藥質量控制研究。E-mail：897353853@qq.com。

*為通信作者，E-mail：hshushi@gxas.cn。