微小RNA-503在結腸癌病人血清中的表達及其臨床意義

結腸癌是起源于大腸的一種惡性腫瘤，其發病率在女性腫瘤中排名第2，在男性腫瘤中排名第3。全球每年新診斷病人約13萬例，并可導致約6萬例病人死亡。盡管各種治療方法取得了一定進展，但是我國病人的5年生存率仍然較低，僅為31%，主要與診斷時間晚、腫瘤細胞轉移等因素有關。因此，探索結腸癌生長、轉移有關的關鍵分子標志物，發展特異性的診斷、治療方法，將對結腸癌病人預后的改善具有重要價值。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一種內源性的、單鏈的、小的非編碼RNA，可與靶信使RNA的3"端非編碼區結合，從而負性調節基因表達。miRNA與細胞增殖、凋亡、分化等生物學行為有關，其異常表達在腫瘤的血管生成、侵襲、轉移中發揮關鍵作用，也是一種有效的診斷標志物和治療靶點。研究發現，miRNA-503在多種腫瘤的發生發展中發揮關鍵的病理作用，包括卵巢癌、前列腺癌等。然而，miRNA-503在結腸癌中的表達及作用尚不清楚，因此本研究旨在探討miRNA-503在結腸癌病人血清中的表達情況，分析其與結腸癌臨床病理特征的關系，評價其在診斷與預后中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年3月至2013年5月在四川大學華西醫院就診的結腸癌病人作為研究對象。根據下述納入與排除標準，共選取了72例結腸癌病人作為觀察組，其中年齡（61.8±2.7）歲，范圍為43～71歲；男性40例，女性32例。手術后核實并完善病人的其他信息，包括腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、臨床分期、淋巴結轉移、遠處轉移等。選取同期該院的50例健康體檢者作為對照組，將可能患有腫瘤者排除，其中年齡（59.6±2.3）歲，范圍為45～70歲；男性28例，女性22例。觀察組與對照組在年齡、性別等一般資料方面差異無統計學意義，具有可比性。所有入選者均簽署了知情同意書，本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。納入標準：（1）經病理學確診為結腸癌；（2）術前均未進行放化療；（3）均擬行手術治療；（4）均知情同意，且愿意接受長期隨訪。排除標準：（1）除結腸癌導致的腫瘤轉移外，仍伴有其他部位的腫瘤；（2）肝腎功能障礙、嚴重的精神疾病及慢性病等。

1.2 主要試劑與儀器

miRNAeasy Mini Kit試劑盒購自德國Qiagen公司；miRNA逆轉錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix熒光定量PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；ABI 7500型熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；引物合成于蘇州金唯智生物科技有限公司，具體序列見表1。

表1 引物序列

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT

-

PCR）檢測血清中miRNA

-

503水平

使用qRT-PCR檢測血清中miRNA-503水平，具體步驟為：觀察組病人在確診后立即留取靜脈血，觀察組和對照組均取5 mL外周靜脈血，放于4℃冰箱至自然凝固，3 000 r/min離心15 min，吸取上層血清。根據miRNAeasy Mini Kit試劑盒說明書提取血清中的總miRNA，使用miRNA逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為互補DNA（cDNA），使用SYBR Green PCR Master Mix熒光定量PCR試劑盒進行擴增。PCR反應條件：95℃預變性10 min；95℃15s，60℃1 min，共40個循環。在熒光定量PCR儀中進行檢測，記錄熒光信號到達設定閾值的循環數，即Ct值，2法計算miRNA-503的相對表達量。

1.4 受試者工作特征曲線評價miRNA

-

503的診斷價值

根據觀察組和對照組血清中miRNA-503水平，作受試者工作特征曲線（Receiver operating characteristic curve，ROC曲線），計算曲線下面積，根據ROC曲線上各坐標點的靈敏度與特異度計算約登指數，約登指數=靈敏度-（1-特異度），取約登指數最大的坐標點，該坐標點對應的miRNA-503表達量為截斷值，即最佳臨界點。

1.5 生存分析評價病人的預后情況

根據觀察組病人血清中miRNA-503水平的中位數，將所有病人分為高表達組和低表達組，各36例。所有病人均于手術后進行隨訪，記錄病人的死亡時間和失訪時間，截止時間為術后72個月。對高表達組和低表達組病人進行生存分析，比較其生存率的差異。

2 結果

2.1 結腸癌病人血清中miRNA

-

503的水平

對血清中miRNA-503水平進行qRT-PCR檢測，結果顯示觀察組血清中miRNA-503水平（0.49±0.02）顯著低于對照組（0.77±0.03）（

t

=8.447，

P

＜0.001）。

2.2 不同臨床病理特征的病人血清中miRNA

-

503水平的比較

結腸癌病人血清中miRNA-503水平與年齡、性別、腫瘤部位、分化程度、浸潤深度、遠處轉移無關，而與腫瘤大小、臨床分期、淋巴結轉移有關。腫瘤大小≥5 cm、臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移的病人血清中miRNA-503水平顯著低于腫瘤大?。? cm、臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移的病人（

P

＜0.05）。見表2。

2.3 miRNA

-

503水平對結腸癌的診斷價值

繪制ROC曲線評價miRNA-503水平對結腸癌的診斷價值，結果顯示ROC曲線下面積為0.859（

P

＜0.001，95%

CI

：0.790～0.928），以miRNA-503表達量為0.685為截斷值時，對結腸癌的診斷靈敏度為0.875，特異度為0.740，見圖2。

表2 不同臨床病理特征結腸癌72例血清微小RNA-503（miRNA-503）水平的比較/±s

圖2 微小RNA-503（miRNA-503）水平診斷結腸癌72例的ROC曲線

2.4 miRNA

-

503水平對結腸癌預后的影響

對不同miRNA-503水平的結腸癌病人進行生存分析，結果顯示低表達組病人的生存率顯著低于高表達組（

χ

=5.376，

P

=0.020），見圖3。

圖3 結腸癌72例中不同微小RNA-503（miRNA-503）水平生存率的比較

3 討論

結腸癌是消化系統中發病率排名第三的惡性腫瘤，其發病原因尚未明確，可能與遺傳、膳食（高脂肪及低纖維素飲食）、息肉、炎癥等多種因素有關，易感人群包括慢性結腸炎、結腸息肉等病人。結腸癌的治療以手術為主，但是術后復發率高、生存率低等問題仍未改善，其主要原因在于早期診斷及預后判斷較為落后。癌胚抗原是一種腫瘤相關抗原，最早從結腸癌和胚胎中提取得到，可從血清、腹水、胃液等多種標本中檢出，以往曾將癌胚抗原作為結腸癌的特異性標志物。隨后研究發現，癌胚抗原是一種廣譜的腫瘤標志物，在肺癌、乳腺癌等其他腫瘤病人中也呈高表達。因此，尋找到與結腸癌臨床病理特征密切相關、具有較好診斷及預后價值的標志物成為結腸癌研究的主要任務之一。

miRNA是一種單鏈非編碼RNA，主要調控靶基因的表達，在腫瘤的發生進展中發揮關鍵作用。血清中一系列不同類型的miRNA已在多種腫瘤中證實呈差異性表達，對高熱、反復凍融、不適宜的pH值等惡劣環境能夠保持較好的穩定性，在早期診斷、病情及療效評估、預后判斷等一系列診療過程中具有潛在的應用前景。miRNA-503是miRNA-16家族的成員，可以負性調節細胞周期，發揮腫瘤抑制效應，例如Xiao等發現miRNA-503在肝癌組織及細胞系中表達降低，其低水平的表達與門靜脈腫瘤血栓、組織學分級、TNM分期、甲胎蛋白水平、預后不良等惡性潛能增強有關，進一步研究發現miRNA-503通過視網膜母細胞瘤蛋白-轉錄因子E2F信號通路誘導G1期阻滯，細胞周期蛋白D3和E2F轉錄調節因子3可能是miRNA-503的直接靶點。本研究在探討miRNA-503在結腸癌病人血清中的表達情況時也發現了相同的趨勢，結腸癌病人血清中miRNA-503水平顯著低于健康體檢者，在腫瘤體積大、臨床分期差、有淋巴結轉移的病人血清中miRNA-503水平顯著降低，但是其水平與年齡、性別、腫瘤部位、分化程度、浸潤深度、遠處轉移無關。上述結果提示miRNA-503與結腸癌的不良病理特征密切相關，可能是關鍵的病理及治療靶點。

ROC曲線廣泛用于評價指標在臨床診斷中的效果，ROC曲線下面積為0.5～0.7代表診斷價值較低，＞0.7～0.9代表診斷價值較好，＞0.9代表診斷價值高。本研究根據觀察組和對照組血清中miRNA-503水平作ROC曲線，結果顯示ROC曲線下面積為0.859，表明miRNA-503水平具有一定的診斷價值，但是仍有很大的提升空間，未來可以考慮多種指標的聯合監測，以提高診斷效果。為了進一步增強miRNA-503在未來診斷試驗中的應用性，本研究分析了其診斷臨界值，即以0.685為截斷值時，對結腸癌的診斷靈敏度為0.875，特異度為0.740。生存率是判斷病人預后的重要指標，為了方便比較不同miRNA-503水平病人的生存率，本研究將所有病人分為高表達組和低表達組，通過隨訪和生存分析發現，低表達組病人的生存率顯著低于高表達組，提示監測miRNA-503水平并采取針對性的治療可能是改善病人預后的關鍵。

綜上所述，miRNA-503在結腸癌病人血清中低表達，與腫瘤大小、臨床分期、淋巴結轉移及預后不良有關，具有較好的診斷價值，可能成為潛在的診斷、治療與預后靶點。